268218662 LTM Biologi Molekular Analisis Deteksi Karbohidrat

8/19/2019 268218662 LTM Biologi Molekular Analisis Deteksi Karbohidrat

http://slidepdf.com/reader/full/268218662-ltm-biologi-molekular-analisis-deteksi-karbohidrat 1/12

Departemen Teknik Kimia, Universitas Indonesia | LTM Biologi Molekular 1

LTM Biologi Molekular

Analisis/Deteksi Karbohidrat

Nama : Rayhan Hafidz I.

NPM : 1306409362

Kelompok Guanin

I. Abstrak

Karbohidrat adalah polyhydroxyaldehyds atau polyhydroxyketones yang memiliki rumus(CH2O)n, atau senyawa yang dapat dihidrolisis menjadi hydroxyaldehyds atau hydroxyketones yanglebih kecil. Karbohidrat biasanya disebut dengan gula atau sakarida. Berdasarkan susunannya,karbohidrat terbagi menjadi empat kategori, yaitu monosakarida, disakarida, oligosakarida,polisakaerida. Karbohidrat memiliki berbagai fungsi penting untuk makhluk hidup, contohnya adalahuntuk bahan bakar (glukosa), cadangan makanan (zat pati pada tumbuhan, glikogen pada hewan),

materi pembangun tubuh makhluk hidup (selulosa pada tumbuhan, zat kitin pada hewan dan jamur),dan sebagai sumber makanan pada tumbuhan melalui proses fotosintesis (pembentukan karbohidratdari karbon dioksida). Karbohidrat banyak dijumpai pada bahan makanan atau serat-serat di sekitarkita. Untuk mengetahui eksistensi karbohidrat sebagai zat esensial dan menguji kadar karbohidrat,kita memerlukan deteksi atau analisis karbohidrat dalam suatu sampel. Analisis tersebut dapat dibagidua, yaitu analisis kualitatif dan kuantitatif. Terdapat enam jenis pengujian secara kualitatif untukmengetahui keberadaan karbohidrat, yaitu uji molisch, uji seliwanoff, uji benedict, uji barfoed, uji iodin,dan uji fehling. Untuk menguji kadar karbohidrat, kita dapat melakukan uji kuantitatif. Pengujiankuantitatif terbagi berdasarkan jenis-jenis karbohidratnya. Dalam karbohidrat, yang merupakanmonosakarida, disakarida, dan oligosakarida, kita dapat menentukan dengan 5 macam uji. Ujipertama adalah menggunakan kromatografi dan elektroforesis. Uji kedua dan uji ketiga adalah ujiyang berdasarkan karakteristik karbohidrat tersebut berdasarkan sifat kimia dan sifat fisika. Pada uji

kimia terdapat 3 macam uji, yaitu uji titrasi, gravimetric, dan kalorimetri. Sedangkan pada uji fisikadapat menggunakan uji pokultmetri, indeks bias, IR, dan densitas. Uji keempat adalah uji enzimatik,dan uji kelima ialah uji immunoarray. Pada pengujian polisakarida, kita dapat menggunakan 4 metodedeteksi, yaitu uji luft-Schoorl, uji Nelson-somogy, uji anthrone, dan uji Folin.

Kata kunci: Karbohidrat, Molisch, Seliwanoff, Benedict, Barfoed, Iodin, Anthrone, fehling, Osazon,Tollens, Moore, kromatografi, elektroforesis, titrasi, gravimetric, kalorimetri, pokultmetri, indeks bias, IR densitas, enzimatis, immunoarray, Luft-Schoorl, Nelson-Somogy, Folin.




II. Analisis Karbohidrat Secara Umum

Analisis karbohidrat ialah cara untuk menguji apakah terdapat kandungan karbohidrat di dalamsampel yang diuji. Analisis secarea garis besar dibagi dua, yaitu analisis kualitatif dan kuantitatif.

Analisis kualitatif bertujuan untuk membedakan jenis karbohidrat yang terdapat pada sampel dandilakukan berdasarkan reaksi warna terhadap beberapa reagen spesifik. Sementara itu, analisiskuantitatif berfungsi untuk mendeteksi jenis-jenis karbohidrat yang terkandung dalam sampel dan

berapa banyak karbohidrat yang terkandung di dalamnya.

III. Analisis Kualitatif Karbohidrat

Analisis kualitatif bertujuan untuk membedakan jenis karbohidrat yang terdapat pada sampeldan dilakukan berdasarkan reaksi warna terhadap beberapa reagen spesifik. Analisis Kualitatifkarbohidrat terbagi menjadi berbagai macam jenis berdasarkan reagen spesifik yang diberikan kedalam sampel. Reaksi warna yang dihasilkan akan menentukan jenis karbohidrat didalamnya.

1. Molisch

Uji molisch adalah uji kimia kualitatif untuk mengetahui adanya karbohidrat pada suatu sample.

Uji Molisch ditemukan oleh seorang alhi botani Australia bernama Hans Molisch. Uji ini didasari olehreaksi dehidrasi karbohidrat oleh asam sulfat.

Sampel yang diuji dicampur dengan reagent Molisch berupa α-naphthol yang terlarut dalametanol. Setelah pencampuran atau homogenisasi, H2SO4 (asam sulfat) pekat perlahan-lahandituangkan melalui dinding tabung reaksi agar tidak sampai bercampur dengan larutan. Reaksi positifditandai dengan munculnya cincin furfural berwarna ungu di permukaan antara lapisan asam danlapisan sampel.

Langkah-langkah pada uji Molisch ialah:

1. Sampel yang diuji dicampur dengan reagent Molisch (α-naphthol) yang terlarut dalam etanol.2. Setelah pencampuran atau homogenisasi, H2SO4 pekat perlahan-lahan dituangkan melalui

dinding tabung reaksi agar tidak sampai bercampur dengan larutan atau hanya membentuklapisan. H2SO4 pekat berfungsi untuk menghidrolisis ikatan pada sakarida untuk

menghasilkan cincin furfural. H2SO4 dapat digantikan dengan asam kuat lainnya.3. Furfural ini kemudian bereaksi dengan reagent Molisch, α-naphthol membentuk cincin yangberwarna ungu.

Berikut ini merupakan proses reaksi yang terjadi pada uji Molisch :

Gambar 1. Reaksi uji Molisch

(http://2.bp.blogspot.com/-5SPgL_JqV1U/U1Epv589xFI/AAAAAAAAAyg/IyjSnLICrjg/s1600/molisch+test.png)

http://2.bp.blogspot.com/-5SPgL_JqV1U/U1Epv589xFI/AAAAAAAAAyg/IyjSnLICrjg/s1600/molisch+test.png







2. Seliwanoff

Uji Seliwanoff ialah uji kimia kualitatif yang membedakan gula aldosa dan ketosa pada suatusample. Ketosa dapat dibedakan dari aldosa. Jika gula mempunyai gugus keton/aldehida, gulatersebut termasuk ketosa. Tetapi jika ia mengandung gugus aldehida, gula tersebut termasuk aldosa.Uji ini didasarkan pada fenomena bahwa ketika dipanaskan, ketosa lebih cepat terdehidrasi daripadaaldosa. Reagen uji Seliwanoff ini terdiri dari resorsinol dan asam klorida pekat. Asam reagen inimenghidrolisis polisakarida dan oligosakarida menjadi gula sederhana.

Ketosa yang terhidrasi kemudian bereaksi dengan resorsinol, menghasilkan zat berwarnamerah tua. Sedangkan aldosa dapat sedikit bereaksi dan menghasilkan zat berwarna merah muda.Fruktosa dan sukrosa adalah dua jenis gula yang memberikan uji positif. Sukrosa menghasilkan ujipositif karena ia adalah disakarida yang terdiri dari furktosa dan glukosa.

Berikut merupakan proses reaksi pada uji Seliwanoff:

Gambar 2. Reaksi uji Seliwanoff

(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/7d/Seliwanow.svg/2000px-Seliwanow.svg.png)

Secara umum, cara kerja metode ini adalah :1. Menyediakan 4 tabung reaksi yang telah berisi label masing-masing sampel.2. Menambahkan 5 ml larutan Barfoed ke masing-masing tabung reaksi yang telah berisi sampel.3. Menuangkan 1 ml larutan sampel ke masing-masing tabung sesuai dengan label.4. Memanaskan selama 3 sampai 5 menit, kemudian angkat.5. Mengamati perubahan yang terjadi

3. Benedict

Uji benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula/karbohidrat pereduksi padasuatu sample. Gula/karbohidrat pereduksi meliputi semua jenis monosakarida dan beberapadisakarida seperti laktosa dan maltosa. Pada uji Benedict, pereaksi akan bereaksi dengan gugusaldehid, kecuali aldehid dalam gugus aromatik, dan α hidroksi keton. Satu liter pereaksi Benedictdapat dibuat dengan menimbang sebanyak 100 gram sodium carbonate anhydrous, 173 gram sodiumcitrate, dan 17,3 gram copper (II) sulphate pentahydrate, lalu dilarutkan dengan 1 liter aquadest.

Untuk mengetahui adanya monosakarida dan disakarida pereduksi pada sample makanan,sample makanan dilarutkan dalam air, dan ditambahkan sedikit pereaksi benedict. Setelahditambahkan, sample dipanaskan dalam waterbath selama 4-10 menit.

Selama proses ini larutan akan berubah warna menjadi biru (tanpa adanya glukosa), hijau,kuning, orange, merah dan merah bata atau coklat (kandungan glukosa tinggi). Sukrosa (gula pasir)tidak terdeteksi oleh pereaksi Benedict. Hal ini dikarenakan sukrosa mengandung dua monosakrida(fruktosa dan glukosa) yang terikat melalui ikatan glikosidic sedemikian rupa sehingga tidakmengandung gugus aldehid bebas dan α hidroksi keton. Sukrosa tidak bersifat pereduksi.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/7d/Seliwanow.svg/2000px-Seliwanow.svg.png







Pada aplikasinya, uji Benedict dapat dilakukan pada urine untuk mengetahui kandunganglukosa. Urine yang mengandung glukosa dapat menjadi tanda adanya penyakit diabetes. Sekaliurine diketahui mengandung gula pereduksi, ujian yang lebih jauh dan detail dilakukan untukmemastikan jenis gula pereduksi apa yang terdapat dalam urine. Gula yang mengindikasikan penyakitdiabetes hanya glukosa.

Contoh reaksi pada uji benedict adalah:

Gambar 3. Reaksi uji Benedict

(http://3.bp.blogspot.com/_tbCAR04Ek0Q/TOIXaz2AtgI/AAAAAAAAArA/oTvoyL8884E/s320/2.jpg)

Secara umum, cara kerja metode ini adalah:1. Menyiapkan 4 tabung reaksi yang telah berisi label masing-masing sampel.2. Menuangkan 5 ml larutan Benedict ke masing-masing tabung reaksi yang telah berisi sampel.

3. Menambahkan 1 ml sampel ke masing-masing tabung reaksi tersebut.4. Memanaskan selama 3 sampai 5 menit, kemudian angkat.5. Mengamati perubahan yang terjadi.

4. Barfoed

Uji Barfoed adalah uji kimia yang digunakan untuk mendeteksi adanya monosakarida dalamsuatu sample. Uji Barfoed di temukan oleh kimiawan Denmark, Christen Thomsen Barfoed. Prinsip ujibarfoed ini didasarkan pada pengurangan tembaga (II) asetat (Kupri asetat) menjadi tembaga (I)oksida (Cu2O/kuprioksida), sehingga terbentuk endapan merah bata. Rumus reaksinya adalah sepertidi bawah ini:

Gambar 4. Reaksi uji Barfoed

(http://pengolahanpangan.blogspot.com/2013/12/uji-barfoed.html)

Untuk melakukan uji barfoed, terlebih dahulu harus di siapkan reagennya. Reagent Barfoedterdiri dari larutan 0,33 molar tembaga asetat netral dalam 1% larutan asam asetat. Ada pendapatyang mengatakan bahwa reagen ini tidak dapat di simpan lama, karena itu disarankan untukmembuatnya ketika benar-benar akan melakukan analisa.

Berikut ini langkah-langkah dalam melakukan uji Barfoed:1. Membuat reagen barfoed. Cara membuat reagen barfoed yaitu menyiapkan 0,33 molar kupri

asetat netral dan larutkan dalam 15 larutan asam asetat.

2. Memasukan 5 ml reagen barfoed kedalam tabung reaksi lalu tambahkan 1 ml sampel yangakan di analisa.

3. Memanaskan tabung reaksi di dalam air mendidih selama 1 menit.

http://3.bp.blogspot.com/_tbCAR04Ek0Q/TOIXaz2AtgI/AAAAAAAAArA/oTvoyL8884E/s320/2.jpg



http://pengolahanpangan.blogspot.com/2013/12/uji-barfoed.html








4. Jika terdapat monosakarida di dalam sample maka akan terbentuk endapan berwarna merahbata (orange), jika sample tidak mengandung monosakarida maka warna larutan tidakberubah.

Berikut contoh hasil negatif atau positif pada sample pada uji Barfoed:

Gambar 5. Contoh hasil pada sample pada uji Barfoed

(http://www.harpercollege.edu/tm-ps/chm/100/dgodambe/thedisk/carbo/barf/barfoed.htm)

5. Fehling

Uji Fehling bertujuan untuk mengetahui adanya gugus aldehid. Reagent yang digunakandalam pengujian ini adalah Fehling A (CuSO4) dan Fehling B (NaOH dan KNa tartarat). Pengujian inimembutuhkan pemanasan agar gugus aldehida pada sampel terbongkar ikatannya dan dapatbereaksi dengan ion OH- membentuk asam karboksilat. Cu2O (endapan merah bata) yang terbentukmerupakan hasil sampingan dari reaksi pembentukan asam karboksilat.

Pereaksi Fehling terdiri dari dua larutan yaitu Fehling A dan Fehling B. Larutan Fehling Aadalah CuSO4 dalam air, sedangkan Fehling B adalah larutan garam KNa tartarat dan NaOH dalamair. Kedua macam larutan ini disimpan terpisah dan baru dicampur saat menjelang digunakan untukmemeriksa suatu karbohidrat.

Dalam pereaksi ini ion Cu²+ direduksi menjadi ion Cu+ yang dalam suasana basa akandiendapkan menjadi CuO2. Fehling B berfungsi mencegah Cu²+ mengendap dalam suasana alkalis.

Berikut reaksi yang terjadi dalam uji fehling:

Gambar 6. Contoh reaksi pada uji Fehling

(http://3.bp.blogspot.com/_tbCAR04Ek0Q/TOIXaz2AtgI/AAAAAAAAArA/oTvoyL8884E/s320/2.jpg)

Secara umum, cara kerja metode ini adalah:1. Menyiapkan pada tabung reaksi masing-masing 2 ml larutan 0.5% glukosa, 1.0% glukosa, dan

2.0% glukosa.2. Menyiapkan larutan fehling (6 ml), mencampurkan antara Fehling A (3 ml) dan Fehling B (3 ml)

dengan volume yang sama.

http://www.harpercollege.edu/tm-ps/chm/100/dgodambe/thedisk/carbo/barf/barfoed.htm














3. Memasukkan 2 ml larutan Fehling kedalam masing-masing tabung reaksi, kocok danpanaskan dengan air mendidih.

4. Mengamati perubahan (warna) yamg terjadi pada masing-masing tabung reaksi.5. Memasukkan sepotong irisan tipis dari pisang mantah kedalam tabung reaksi, dan sepotong

irisan tipis dari pisang yang telah masak sempurna kedalam tabung reaksi lain.6. Menghancurkan irisan tipis pisang tersebut, dan tambahkan 2 ml larutan Fehling kedalam

tabung reaksi

6. Iodine

Pada uji iodine, kondensasi iodine dengan karbohidrat, selain monosakarida dapatmenghasilkan warna yang khas. Amilum dengan iodine dapat membentuk kompleks biru, sedangkandengan glikogen akan membentuk warna merah. Umumnya, uji iodine dilakukan untuk membedakanantara amilum, glikogen, dan selulosa.

Setelah tabung diuji iod, warna yang muncul berturut-turut adalah biru pekat (hitam), coklatkemerahan, merah hati, merah, orange dan akhirnya warna serupa dengan warna iod. Warna-warnatersebut merupakan indikasi bahwa terjadi proses hidrdolisis sempurna amilum menjadi glukosa. Halini ditunjukkan dengan uji iod negatif, karena glukosa jika diuji dengan pereaksi iod akan memberikanhasil negatif.

Contoh hasil reaksinya adalah: Amilum + I2 --> Biru

Glikogen + I2 --> Merah coklat

Selulosa + I2 --> Negatif

7. Anthrone

Penggunaan Metode Anthrone untuk analisis total karbohidrat mulai berkembang sejakpenggunaan pertama kali oleh Dreywood pada tahun 1946 untuk uji kualitatif.

Dasar dari reaksi ini adalah kemampuan karbohidrat untuk membentuk turunan furfuraldengan keberadaan asam dan panas, yang kemudian diikuti dengan reaksi dengan anthrone yangmenghasilkan warna biru kehijauan. Uji Anthrone ini memiliki kelebihan dalam hal sensitifitas dankesederhanaan ujinya. Kekurangan dari Metode Anthrone adalah ketidakstabilan dari reagen(anthrone yang dilarutkan dalam asam sulfat), sehingga perlu dilakukan persiapan reagen yang barusetiap hari.

8. Osazon

Uji Osazon bertujuan membedakan bermacam-macam karbohidrat dari gambar kristalnya.Dasar teorinya adalah semua karbohidrat yang mempunyai gugus aldehida atau keton bebas akanmembentuk hidrazon atau osazon bila dipanaskan bersama fenilhidrazin berlebih.

Osazon yang terjadi mempunyai bentuk kristal dan titik lebur yang spesifik. Osazon daridisakarida larut dalam air mendidih dan terbentuk kembali bila didinginkan. Namun, sukrosa tidakmembentuk osazon karena gugus aldehida atau keton yang terikat pada monomernya sudah tidakbebas. Sebaliknya, osazon dari monosakarida tidak larut dalam air mendidih.

Prosedur kerja uji osazon ini adalah:

1. Memasukan 2 ml larutan uji ke dalam tabung reaksi2. Menambahkan seujung spatula fenilhidrazin-hidroklorida dan kristal natrium asetat3. Memanaskan dalam penangas air selama beberapa menit4. Mendinginkan perlahan-lahan dalam air keran5. Memperhatikan kristal yang terbentuk dan mengidentifikasinya di bawah mikroskop




9. MooreUji Moore menggunakan NaOH (alkali) yang berfungsi sebagai ion OH - yang akan berikatan

dengan rantai aldehid yang membentuk aldol aldehid (aldehida dengan cabang gugus alkanol) yangberwarna kekuningan. Pemanasan bertujuan untuk membuka ikatan karbon dengan hydrogen danmenggantikannya dengan gugus –OH.Cara kerja metode ini adalah:

1. Menyiapkan 4 tabung reaksi yang telah berisi label masing-masing sampel.

2. Memasukkan sampel ke tabung sesuai dengan labelnya sebanyak 5 ml.3. Mengisi masing-masing tabung dengan 1 ml NaOH.4. Memanaskan kedalam panic yang telah berisi air mendidih.5. Menunggu selama 5 menit kemudian angkat.6. Mengamati perubahan yang terjadi.

10. Tollens Tollens terdiri dari Ag2SO4 yang bila ada gula pereduksi Ag akan direduksi menjadi Ag + yang

akan membentuk cinci perak. Kelemahan dari reaksi Tollens adalah ia tidak hanya bereaksi dengangula pereduksi tetapi juga bereaksi dengan senyawa keton yang mempunyai gugus metil.

Cara kerja metode ini adalah:1. 1 ml larutan AgNO3 dicampurkan kemudian 2 tetes NaOH 10% (ditetes demi tetes) dan

ammonia encer.2. Mencampuran di atas di aduk kemudian menambahkan 1 ml larutan sampel ( karbohidrat)

didiamkan selama 5 menit.3. Jika tidak terjadi reaksi larutan dipanaskan.4. Pada semua larutan sampel dilakukan hal yang sama5. Hasil pengamatan dicatat.

IV. Analisis Kuantitatif Karbohidrat

Bentuk karbohidrat terdiri dari tiga jenis, yaitu monosakarida, oligosakarida, dan polisakarida.Olisakarida tersusun dari 2-10 unit monoskarida, sementara itu polisakarida tersusun atas lebih dari

10 unit monosakarida. Contoh-contoh dari monosakarida adalah glukosa, oligosakarida adalahsukrosa, serta polisakarida adalah amilum, pati, gum, pektin, dan selulosa.

Karbohidrat jenis Monosakarida dan disakarida mempunyai sifat mereduksi. Gula reduksiadalah gula yang mempunyai kemampuan untuk mereduksi. Hal ini dikarenakan adanya gugusaldehid atau keton bebas atau karena adanya gugus hidroksi yang bebas dan reaktif. Contoh gulayang termasuk gula reduksi adalah glukosa, manosa, laktosa, maltosa, fruktosa, dan galaktosa.Sedangkan gula non reduksi adalah senyawa gula yang gugus karbonilnya berikatan dengansenyawa monosakarida lain sehingga tidak bebas lagi. Contohnya adalah sukrosa.

Dalam menentukan karbohidrat apakah ia polisakarida atau oligosakarida, kita memerlukanperlakuan pendahuluan sehingga diperoleh monosakarida. Pada keperluan ini maka bahan perludihidrolisis dengan asam atau enzim pada suatu keadaan yang tertentu.

Uji kuantitatif untuk menentukan kadar karbohidrat dapat dilakukan dengan berbagai macammetode, yaitu.:

1. Metode fisika

Terdapat 2 macam metode fisika, yaitu :

Indeks bias

Metode indeks bias menggunakan alat refraktometer. Metode ini menggunakan rumus:

( ) )




Keterangan:X = % sukrosa atau gula yang diperoleh

A = berat larutan sampel (g)B = berat larutan pengencer (g)C = % sukrosa dalam campuran A dan B dalam tabelD = % sukrosa dalam pengencer B

Rotasi optisMetode rotasi optis menggunakan alat polarimeter digital (dapat diketahui hasilnya langsung)

dinamakan sakarimeter. Hukum Biot menyatakan bahwa : “besarnya rotasi optis tiap individu gulasebanding dengan konsentrasi larutan dan tebal cairan”.

[a] D20 = 100 AL x C

Keterangan:[a] D20 = rotasi jenis pada suhu 20 oC menggunakanD = sinar kuning pada panjang gelombang 589 nm dari lampu Na

A = sudut putar yang diamatiC = kadar (dalam g/100 ml)

L = panjang tabung (dm) sehingga C = 100 AL x [a] D20

2. Metode kimia

Terdapat 2 macam cara metode kimia, yaitu :

Titrasi

Untuk cara yang pertama ini dapat melihat metode yang telah distandarisasi oleh BSN yaitupada SNI cara uji makanan dan minuman nomor SNI 01-2892-1992.

Spektrofotometri

Spektrofotometri menggunakan prinsip reaksi reduksi CuSO4 oleh gugus karbonil pada gula

reduksi yang setelah dipanaskan akan terbentuk endapan kupru oksida (Cu2O) kemudianditambahkan Na-sitrat dan Na-tatrat serta asam fosfomolibdat sehingga terbentuk suatu kompleksenyawa berwarna biru yang dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 630nm.

3. Metode enzimatik

Analisis karbohidrat dengan cara enzimatik sangat tepat terutama untuk tujuan penentuankarbohidrat tertentu yang ada dalam suatu campuran berbagai macam karbohidrat. Cara kimiawimungkin sulit untuk penentuan secara individual yang ada dalam campuran itu, tetapi dengan caraenzimatis ini penentuan gula tertentu tidak akan mengalami kesulitan karena tiap enzim sudah sangatspesifik untuk gula yang tertentu.

Metode enzimatik cocok untuk digunakan dalam menentukan kadar suatu gula secara

individual, disebabkan kerja enzim yang sangat spesifik. Contoh enzim yang dapat digunakan adalahglukosa oksidase dan heksokinase, dimana keduanya digunakan untuk mengukur kadar glukosa.

4. Metode kromatografi

Analisis karbohidrat secara kromatografi adalah analisis dengan mengisolasi danmengidentifikasi karbohidrat dalam suatu campuran. Isolasi karbohidrat ini berdasarkan prinsippemisahan suatu campuran berdasarkan perbedaan distribusi rationya pada fase tetap dengan fasebergerak.




Fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas sedangkan fase tetap dapat berupa zat atau zatcair. Apabila zat padat sebagai fase tetapnya maka disebut kromatografi serapan, sedang bila zat cairsebagai fase tetapnya disebut kromatografi partisi.

5. Metode Nelson-Somogyi

Nama lain metode Nelson-Somogyi ialah metode oksidasi dengan kupri. dapat digunakanuntuk mengukur kadar gula reduksi dengan menggunakan pereaksi tembaga arseno molibdat. Kupri

mula-mula direduksi menjadi bentuk kupro dengan pemanasan larutan gula. Kupro yang terbentukselanjutnya dilarutkan dengan arseno molibdat menjadi molibdenum berwarna biru yang menunjukkanukuran konsentrasi gula dan membandingkannya dengan larutan standar sehingga konsentrasi guladalam sampel dapat ditentukan. Reaksi warna yang terbentuk dapat menentukan konsentrasi guladalam sampel dengan mengukur absorbansinya.

Secara berurutan, langkah-langkah dalam analisis Nelson-Somogyi adalah sebagai berikut:

1. Mengambil 1 ml larutan sampel.2. Menambahkan 1 ml reagen Nelson pada tiap-tiap tabung reaksi dan dipanaskan dalam air

mendidih selama 20 menit, kemudian didinginkan 5 menit dalam air mengalir.3. Menambahkan 1 ml reagen arsenomolibdat pada tiap-tiap tabung reaksi, dikocok sampai

homogen dan larut sempurna.4. Menambahkan 7 ml aquadest pada tiap-tiap tabung reaksi, kemudian dikocok.

5. Mengukur absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.6. Menentukan kadar gula reduksi sampel dengan menggunakan persamaan kurva standard.

6. Analisis dengan Metode Luff-Schoorl

Di dalam analisis Luff-Schrool, yang ditentukan bukan kuprooksida yang mengendap, tetapidengan menentukan kupri oksida dalam larutan sebelum direaksikan dengan gula reduksi (titrasiblanko) dan sesudah direaksikan dengan sampel gula reduksi (titrasi sampel). Penentuannya dengantitrasi menggunakan Natrium tiosulfat. Selisih titrasi blanko dengan titrasi sampel ekuivalen dengankupro oksida yang terbentuk dan juga ekuivalen dengan jumlah gula reduksi yang ada dalam bahanatau larutan. Reaksi yang terjadi selama penentuan karbohidrat cara ini mula-mula kupri oksida yangada dalam reagen akan membebaskan iod dari garam kalium iodida.

Banyaknya iod yang dibebaskan ekuivalen dengan banyaknya kupri oksida. Banyaknya ioddapat diketahui dengan titrasi menggunakan Natrium tiosulfat. Untuk mengetahui bahwa titrasi sudahcukup maka diperlukan indikator amilum. Apabila larutan berubah warnanya dari biru menjadi putihberarti titrasi sudah selesai. Agar perubahan warna biru menjadi putih dapat tepat maka penambahanamilum diberikan pada saat titrasi hampir selesai. Setelah diketahui selisih banyaknya titrasi blankodan titrasi sampel kemudian dikonsultasikan dengan tabel yang sudah tersedia yang menggambarkanhubungan antara banyaknya Natrium tiosulfat dengan banyaknya gula reduksi.

Metode Luff-Schoorl dapat diaplikasikan untuk produk pangan yang mengandung gula denganbobot molekuler yang rendah dan pati alami atau modifikasi. Kemampuan mereduksi dari gugusaldehid dan keton digunakan sebagai landasan dalam mengkuantitasi gula sederhana yang terbentuk.

Secara berurutan, langkah-langkah dalam analisis Luff-Schoorl adalah sebagai berikut:

1. Memipet sample sebanyak 5 ml ke dalam erlenmeyer kemudian tambahkan 35 ml aquades

dan 10 ml larutan luff.2. Memanaskan sampai mendidih3. Mendinginkan dalam wadah berisi air.4. Menambahkan 10 ml larutan KI 25% dan 17 ml H2SO4 6N perlahan-lahan lewat dinding.5. Menambahkan 2 ml amilum, amati perubahan warna yang terjadi (biru tua).6. Menitrasi dengan larutan Natrium tiosulfat 0,005N sampai warna biru tua hilang.7. Mencatat volume titrasi.




7. Analisis dengan Metode Folin

Analisis Folin mempunyai prinsip-prinsip yaitu filtrat darah bebas protein dipanaskan denganlarutan CuSO4 alkali. Endapan CuO yang dibentuk oleh glukosa akan larut dengan penambahanlarutan fosfo molibdat. Larutan ini dibandingkan secara kolorimetri dengan larutan standar glukosa.

8. Analisis dengan metode Immunoassay

Analisis metode Immunoassay ini digunakan spesifik untuk karbohidrat dengan berat molekul

yang rendah. Cara penggunaan metode ini adalah:1. Karbohidrat diasosiasikan dengan protein, dan kemudian diinjeksikan ke tubuh hewan.2. Tubuh hewan akan membentuk antibody bagi karbohidrat tersebut.3. Antibodi ini kemudian dapat diekstrak dari tubuh hewan dan digunakan sebagai bagian dari

test kit untuk menentukan konsentrasi karbohidrat tertentu dalam makanan.

Kelebihan metode ini : sangat sensitif, spesifik, mudah digunakan dan cepat.




V. Summary

Karbohidrat menunjukkan bentuk utama energi kimia, baik dari tumbuhan maupun hewan.Karbohidrat banyak dijumpai pada bahan makanan maupun serat-serat yang ada di sekitar kita, untukmengetahui keberadaan karbohidrat sebagai zat esensial, dan mengetahui kadar dari karbohidrattersebut, maka kita perlu mendeteksi atau menganalisis karbohidrat dalam suatu sampel.

Menguji apakah ada karbohidrat dalam sampel tersebut dilakukan dengan pengujian kualitatif,

dimana terdapat enam jenis pengujian secara kualitatif yaitu uji molisch, uji seliwanoff, uji benedict, ujibarfoed, uji iodin dan iod, serta uji fehling.

Untuk menguji berapa banyak kadar karbohidrat, kita dapat menentukannya dengan melakukanuji kuantitatif. Pengujian ini terbagi lagi berdasarkan jenis-jenis karbohidratnya. Pada karbohidrat yangmerupakan monosakarida, disakarida, dan oligosakarida, kita dapat menentukan dengan 5 macam uji.Uji pertama adalah menggunakan kromatografi dan elektroforesis. Uji kedua dan uji ketiga merupakanuji yang berdasarkan karakteristik karbohidrat tersebut berdasarkan sifat kimia dan sifat fisika. Pada ujikimia terdapat 3 macam uji, yaitu uji titrasi, gravimetric, dan kalorimetri. Sedangkan pada uji fisika dapatmenggunakan uji pokultmetri, indeks bias, IR, dan densitas. Uji keempat merupakan uji enzimatik, danuji kelima merupakan uji immunoarray. Pada pengujian polisakarida, kita dapat menggunakan 4 metodedeteksi, yaitu uji Luft-Schoorl, uji Nelson-Somogy, uji Anthrone, dan uji Fehlin.

268218662 LTM Biologi Molekular Analisis Deteksi Karbohidrat

Documents

Transcript of 268218662 LTM Biologi Molekular Analisis Deteksi Karbohidrat