AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT

[Lansium Domesticum L.]

MOKOSULI YERMIA SEMUEL

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2008

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang Langsat (Lansium domesticum L.) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Februari 2008 Mokosuli Yermia Semuel NIM G851060061

ABSTRACT

MOKOSULI YERMIA SEMUEL. Antioxidation and anticancer activity of tree barks of Langsat (Lansium domesticum L.). Under direction of MARIA BINTANG and MEGA SAFITHRI.

Oxidative stress by radical oxygen species (ROS) caused cell damaged and cancer. The objective of this research was to know the activity of etanol extract of tree barks from Langsat (Lansium domectisumL.) dried (KBLK) and wet (KBLB) as antioxidation and anticancer. This research consisted of four steps, the first step was extration and phytochemistry analysis using Harborne method. The second step was Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) to know the toxicity of the extract using Mc Laughlin method. The third step was examination of antioxidation activity using DPPH method and TBA method and the last step was examination of anticancer activity of the extract using murine leukimia P388 cell line. The result of this research showed that etanol extract of tree barks of L. domesticum L. had antioxidation and anticancer activity. The IC50 of BSLT was 93.48 g/ml and 100,37 g/ml respectively. The IC50 of antioxidation activity using DPPH method was 174,19 g/ml and 205,38 g/ml respectively. Inhibition of linoleat oxidation by TBA method was 82,83% and 85,22%. The IC50 of anticancer test was 12.00 g/ml and 15.48 g/ml. The result of phytochemistry analysis showed KBLK and KBLB have alkaloid, flavonoid, saponin and tanin compounds. The conclusion of this experiment ware etanol extract of KBLK and KBLB have a strong anticancer and antioxidation activity. Keywords : Lansium domesticum L, antioxidation, anticancer.

RINGKASAN

MOKOSULI YERMIA SEMUEL. Aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang langsat (Lansium domesticum L.) dibimbing oleh MARIA BINTANG dan MEGA SAFITHRI.

Kematian akibat kanker di Amerika Serikat menempati posisi kedua setelah penyakit jantung. Diperkirakan satu dari tiga orang di AS mengalami perkembangan kanker dalam tubuhnya (Cooper, 1993). Kanker menyebabkan lebih dari 500.000 kematian tiap tahun di Amerika Serikat (Katzung, 1995). Insiden kanker di Indonesia diperkirakan 100 per 100.000 penduduk per tahun atau sekitar 200.000 penduduk per tahun (Puspitasari et al. 2003).

Akhir-akhir ini upaya pengobatan kanker dengan kemoterapi banyak dilakukan. Bahan kemoterapi dari tumbuhan mempunyai prospek sebagai penghambat kanker yang lebih sedikit efek sampingnya. Distribusi senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antikanker sangat luas dalam tumbuh-tumbuhan. National Cancer Institute melakukan skreening sekitar 114.000 ekstrak tumbuhan dari tahun 1960 sampai 1982 dan menemukan sekitar 35.000 sampel tumbuhan memiliki aktivitas antikanker. Tahun 1991 sekitar 28.000 sampel tumbuhan dari seluruh dunia telah dikoleksi karena memiliki aktivitas antikanker. Sekitar 62 % dari 87 jenis obat antikanker berasal dari bahan alam (Cragg, 1993). Salah satu tanaman asli Indonesia yang diduga memiliki potensi anti kanker adalah langsat (L. domesticum L). Secara empiris tanaman ini telah digunakan masyarakat pedalaman Kalimantan dan Minahasa sebagai obat antimalaria, tumor dan kanker. Biji tanaman ini secara tradisional telah digunakan untuk mengobati penyakit parasit malaria. Namun belum ada laporan ilmiah pemanfaatan ekstrak bagian tanaman ini sebagai obat antikanker. Kearifan budaya etnomedikal masyarakat Indonesia yang diperoleh turun temurun perlu dilestarikan dan dikembangkan sehingga dapat bermanfaat bagi kesejahteraan manusia. Untuk membuktikan secara ilmiah dilakukan penelitian dengan tujuan mengetahui kandungan senyawa fitokimia yang memiliki aktivitas antioksidan dan antikanker dari ekstrak kulit pohon langsat [L. domesticum L] dan mengetahui aktivitas in vitro antioksidasi dan aktivitas antikanker ekstrak kulit pohon Langsat [L. domesticum L.] pada sel kanker murine leukimia P-388.

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB dan Laboratorium Kimia Bahan Alam Institut Teknologi Bandung. Penelitian dimulai bulan September 2007 sampai dengan Januari 2008. Kulit batang langsat (L. domesticum L.) diperoleh dari perkebunan rakyat Minahasa Utara propinsi Sulawesi Utara. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pareaksi Dragendorff, pareaksi Mayers, pareaksi Wagner, etanol 95%, HCL, logam Mg, Na2CO3, FeCl3, H2SO4 dan anhidrida asetat. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), butil hidroksi toluena (BHT), NaOH 10 % asam asetat anhidrida, kertas saring, air bebas ion, etanol 75%, etanol absolut, asam linoleat, buffer fosfat 0.1 M pH 7, Fe CL2.4H2O, HCL, amonium tiosianat, -tokoferol, 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 M, asam tiobarbiturat (TBA), asam asetat 50 % dan asam trikloroasetat (TCA) 20 %. Sel kanker murine leukimia P-388, media RPMI, serum fetal bovine, kanamisin, reagen pewarna 3-(4,5-dimetil thiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolium bromida, larutan 10% SDS-0,01 N HCL. Alat yang digunakan antara lain tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas ukur, erlenmeyer, pengaduk, hot plate dan neraca

analitik, pH indikator, botol gelap berulir, inkubator, sentrifuse model 800, spektrofotometer UV-Vis U-2800 Hitatchi, perangkat sumur kultur, mikropipet dan microplate reader.

Penelitian ini terdiri atas empat tahap yaitu : (1) Ekstraksi dan analisis fitokimia (2) Uji toksisitas metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (3) Analisis potensi antioksidasi in vitro menggunakan metode DPPH dan metode TBA dan (4) Analisis potensi antikanker secara in vitro menggunakan sel murine leukimia P388.

Hasil analisa fitokimia pada ekstrak etanol 70% dan kloroform:air menunjukkan adanya senyawa fitokimia golongan alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin. Senyawa triterpenoid dan steroid hanya dalam intensitas yang sedikit. Berdasarkan nilai LC50 dari hasil uji BSLT ekstrak KBLK EtOH (LC50 93,48 ppm) dan KBLB (LC50 100,37 ppm) menunjukkan aktivitas toksisitas yang kuat. Suatu ekstrak tumbuhan berpotensi antikanker dengan uji BSLT menurut NCI jika nilai LC50

Hak cipta milik IPB, tahun 2008

Hak cipta dilindungi undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,

penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu makalah.

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau

seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

AKTIVITAS ANTIOKSIDASI DAN ANTIKANKER

EKSTRAK KULIT BATANG LANGSAT [Lansium Domesticum L.]

MOKOSULI YERMIA SEMUEL

Tesis Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Magister Sains pada Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2008

Judul : Aktivitas Antioksidasi dan Antikanker Ekstrak Kulit Batang Langsat [Lansium domesticum L.] Nama : Mokosuli Yermia Semuel NRP : G851060061

Disetujui :

Komisi Pembimbing

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Mega Safithri, S.Si, M.Si Ketua Anggota

Diketahui :

Ketua Program Studi Biokimia Dekan Sekolah Pascasarjana IPB

Prof.Dr.drh.Maria Bintang, MS Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro, MS

Tanggal Ujian : 17 Maret 2008 Tanggal lulus :

PRAKATA

Saya sangat bersyukur kepada TUHAN karena tanpa anugerahNya saya tidak pernah mendapat kesempatan studi di Institut Pertanian Bogor dan dapat menyelesaikan tugas akhir program magister biokimia. Suatu kebanggaan bagi saya untuk dapat belajar biokimia di Institut Pertanian Bogor. Atas ketertarikan penulis dalam bidang pemanfaatan bahan tumbuhan sebagai sumber obat maka penulis melakukan penelitian tentang aktivitas antioksidasi dan antikanker ekstrak kulit batang Langsat [Lansium domesticum L.]. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan September 2007 sampai awal Februari 2008. Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Ibu Prof Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Ibu Mega Safithri, SSi, MSi selaku pembimbing atas segala arahan dan bimbingan selama penelitian serta kepercayaan dan kesabaran dalam membimbing sampai terselesaikannya penyusunan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Rektor Universitas Negeri Manado bapak Prof.Drs.J.L.L.Lombok,SH yang memberikan kesempatan belajar di IPB Bogor dengan biaya BPPS Direktorat Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional. Semasa studi ada banyak orang yang membantu saya namun tidak ada yang melebihi bantuan isteri tercinta Reinny S. Tuegeh, SSi yang dengan tekun dan sabar memberi semangat serta mendoakan keberhasilan studi juga orang tua yang turut menopang dalam doa. Kepada teman-teman Biokimia angkatan 2006 disampaikan terima kasih atas bantuan dan dukungan selama studi. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2008 Mokosuli Y. Semuel

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Tambun Kabupaten Bolaang Mongondow pada tanggal 21 Maret 1980 dari Ayah Benyamin Gayus Mokosuli dan Ibu Mien Ritha Suoth. Penulis adalah putera pertama dari tiga bersaudara.

Tahun 2003 menyelesaikan pendidikan sarjana sains biologi di FMIPA Universitas Negeri Manado dengan predikat cum laude. Setelah lulus dipanggil sebagai asisten dosen di Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Manado disamping mengajar mata pelajaran Biologi di SMA Kristen Binaan khusus Tomohon. Tahun 2005 diangkat menjadi staf dosen pegawai negeri sipil di Universitas Negeri Manado pada FMIPA Jurusan Biologi. Tahun 2006 mendapatkan kesempatan tugas belajar di Institut Pertanian Bogor Program Magister Biokimia dengan biaya BPPS Dikti Depdiknas. Di tahun yang sama TUHAN memberikan pendamping hidup Reinny Silvana Tuegeh, S.Si.

DAFTAR ISI

Halaman DAFTAR TABEL ..........................................................................................

DAFTAR GAMBAR .....................................................................................

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................

xi

xii

xiii

PENDAHULUAN .........................................................................................

1

TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Langsat ............................................................................... Radikal Bebas ..................................................................................... Antioksidan ........................................................................................ Kanker ................................................................................................

6 7 9

13

BAHAN DAN METODE Waktu dan tempat ............................................................................... Bahan dan alat ..................................................................................... Diagram alir penelitian ....................................................................... Ekstraksi kulit batang Lansium domesticum L. .................................. Analisisi fitokimia ............................................................................... Uji toksisitas metode BSLT ................................................................ Uji aktivitas antioksidasi ..................................................................... Uji aktivitas antikanker pada sel murine leukimia P388 .................... Analisis data ....................................................................................... HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi ............................................................................................ Analisis fitokimia ............................................................................. Aktivitas toksisitas metode BSLT ..................................................... Aktivitas antioksidasi metode DPPH ................................................ Aktivitas antioksidasi metode TBA .................................................. Aktivitas antikanker pada sel murine leukimia P388 .......................

SIMPULAN DAN SARAN .........................................................................

25 25 26 27 27 28 28 30 30

32 33 34 36 40 46

51

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................

LAMPIRAN ..................................................................................................

53

60

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Klasifikasi umum agen karsinogenesis .............................................

2. Flavonoid antikanker ........................................................................

3. Rendemen ekstrak KLBB dan KLBK ................................................

15

21

32

4. Hasil analisis fitokimia KLBB dan KLBK ........................................

5. Nilai LC50 ekstrak etanol KBLK dan KBLB ....................................

6. Nilai IC50 aktivitas antioksidan ekstrak metode DPPH dibandingkan

dengan kontrol BHT ....................................................

7. Aktivitas inhibisi ekstrak terhadap radikal DPPH .............................

8. Konsenterasi MDA oksidasi asam linoleat metode TBA .................

9. Perbandingan aktivitas antioksidasi, toksisitas dan antikanker

ekstrak etanol kulit batang langsat .....................................................

33

35

36

37

41

48

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Batang, daun dan buah langsat (Lansium domesticul L.) ..

2. Interaksi species oksigen reaktif (ROS) terhadap biomolekul di

dalam sel ............................................................................................

3. Keseimbangan radikal bebas-antioksidan sangat diperlukan di

dalam tubuh ........................................................................................

4. Mutasi dan proses perkembangan kanker hati ...................................

5. Tipe progresi tumor ............................................................................

6. Ceflatonin dan phenoxodiol, obat antikanker dari tumbuhan ............

7. Diagram alir penelitian .....................................................................

8. Histogram mortalitas A. Salina Leach pada berbagai konsenterasi

ekstrak ................................................................................................

9. Reaksi antara DPPH dan antioksidan .................................................

10. Struktur flavonoid dengan aktivitas antiradikal yang tinggi .............

11. Reaksi Scavenging radikal bebas DPPH* oleh flavonoid ..................

12. Daya hambat oksidasi asam linoleat ekstrak. (a) KBLK EtOH

(b) KBLB EtOH .................................................................................

13. Peroksidasi lipid pada asam lemak tak jenuh rantai panjang .............

14. Reaksi MDA dan TBA .......................................................................

15. Perbandingan aktivitas antioksidasi metode DPPH dan TBA ...........

16. Perbandingan aktivitas toksisitas ekstrak metode BSLT dan

sitotoksik in vitro pada sel murine leukimia P388 .............................

6

9

11

14

15

22

26

35

37

39

39

42

43

44

45

47

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Diagram alir penelitian .......................................................................

2. Ekstraksi kulit batang Lansium domesticum L.

3. Analisis antioksidasi metode TBA .....................................................

4. Pengambilan sampel dan eksraksi ......................................................

5. Hasil ekstraksi dan analisis fitokimia .................................................

6. Analisis hasil uji toksisitas metode BSLT .........................................

7. Analisis hasil uji antioksidasi metode DPPH .....................................

8. Analisis hasil uji antioksidasi metode TBA .......................................

9. Hasil uji sitotoksik in vitro pada sel murine leukimia P388 ..............

10. Formulasi media RPMI ......................................................................

60

61

62

66

67

69

72

75

80

81

PENDAHULUAN

Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak

terkendali dengan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis

lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan

(invation) atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis). Pertumbuhan

yang tidak terkendali tersebut disebabkan oleh kerusakan DNA yang

mengakibatkan mutasi pada gen vital yang mengontrol pembelahan sel. Beberapa

kejadian mutasi dapat mentransformasi materi genetik sel normal menjadi sel

kanker. Mutasi-mutasi tersebut dapat diakibatkan oleh agen kimia, biologi

maupun fisik yang disebut karsinogen. Mutasi dapat terjadi secara spontan

(diperoleh) ataupun diwariskan (mutasi germline).

Kanker telah menjadi penyakit yang sangat ditakuti saat ini. Kematian

akibat kanker di Amerika Serikat menempati posisi kedua setelah penyakit

jantung. Diperkirakan satu dari tiga orang di AS mengalami perkembangan kanker

dalam tubuhnya (Cooper, 1993). Kanker menyebabkan lebih dari 500.000

kematian tiap tahun di Amerika Serikat (Katzung, 1995). Laporan berbagai

lembaga riset penelitian kanker di Indonesia menyatakan prevelensi penyakit

kanker di Indonesia cenderung meningkat. Insiden kanker di Indonesia

diperkirakan 100 per 100.000 penduduk per tahun atau sekitar 200.000 penduduk

per tahun (Puspitasari et al. 2003).

Kanker terjadi pada sel-sel normal melalui suatu kesalahan genetika,

kemudian berubah menjadi sel-sel ganas yang berploriferasi dengan cepat. Kanker

lebih mudah tejadi pada sel yang terus menerus membelah dan memperbanyak

diri, misalnya sel-sel kulit, sel-sel epitel lambung, saluran pencernaan dan paru-

paru sebagai akibat hubungan yang sangat intensif dengan faktor lingkungan

(udara dan makanan) sehingga lebih mudah dipengaruhi senyawa karsinogenik.

Proses perubahan ini dikenal dengan istilah karsinogenesis. Karsinogenesis dibagi

dalam beberapa tahap yaitu inisiasi, promosi dan progresi (Contran et al. 1994).

Tumor (bahasa Latin = pembengkakan) menunjukan massa jaringan yang tidak

normal, tetapi dapat berupa "ganas" (bersifat kanker) atau "jinak" (tidak bersifat

2

kanker). Tumor ganas yang mampu menyerang jaringan lainnya ataupun

bermetastasis.

Perubahan pola makan di negara-negara berkembang seperti Indonesia

mulai meninggalkan makanan tradisional ke makanan cepat saji (fast food)

memberikan efek yang tidak baik bagi kesehatan. Makanan yang disukai

masyarakat Indonesia pada umumnya saat ini adalah makanan dengan kandungan

lemak/minyak tinggi (gorengan), daging dan produk olahan daging, makanan

dengan kandungan garam/penyedap tinggi serta makanan olahan dengan

pengawet. Jenis-jenis makanan tersebut telah menjadi makanan idola jajanan

anak-anak sekolah maupun masyarakat umum. Akibatnya muncul penyakit non

infektif seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi dan kanker.

Disamping hal tersebut di atas, Indonesia sebagai negara dengan wilayah

laut yang luas sehingga masyarakat sangat menyukai mengkonsumsi ikan.

Konsumsi ikan laut sangat baik bagi kesehatan karena mengandung protein tinggi

dan asam lemak esensial yang dibutuhkan oleh tubuh. Namun bentuk olahan ikan

yang mudah dan umum dilakukan dengan panggangan dan pengasapan. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa ikan atau daging yang hangus setelah dipanggang

mengandung senyawa polisiklik aromatik hidrokarbon yang merupakan

karsinogen kuat. Proses pengasapan daging atau ikan membentuk benzo(a)pirene

yang bersifat karsinogen kuat. Penggunaan minyak goreng berulang kali dapat

menyebabkan terjadinya oksidasi atau polimerisasi menghasilkan asam lemak

trans atau bentuk-bentuk senyawa radikal bebas yang bila dikonsumsi dapat

menimbulkan kerusakan seluler (Greenwald, 1996).

Karsinogenesis berlangsung dalam waktu yang lama sekitar 10 sampai 20

tahun tetapi dapat juga terjadi lebih cepat tergantung pada intensitas paparan agen-

agen karsinogenik. Kanker dapat menyebabkan banyak gejala yang berbeda,

bergantung pada lokasinya dan karakter dari keganasan dan apakah ada

metastasis. Sebuah diagnosis yang menentukan biasanya membutuhkan

pemeriksaan mikroskopik jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah

didiagnosis, penderita kanker biasanya dirawat dengan operasi, kemoterapi atau

radiasi. Bila tidak segera di obati, kebanyakan kanker menyebabkan kematian.

3

Akhir-akhir ini upaya pengobatan kanker dengan kemoterapi banyak

dilakukan. Bahan kemoterapi dari tumbuhan mempunyai prospek sebagai

penghambat kanker yang lebih sedikit efek sampingnya. Distribusi senyawa

fitokimia yang memiliki aktivitas antikanker sangat luas dalam tumbuh-

tumbuhan. NCI (National Cancer Institute) melakukan skrining sekitar 114.000

ekstrak tumbuhan dari tahun 1960 sampai 1982 dan menemukan sekitar 35.000

sampel tumbuhan memiliki aktivitas antikanker. Tahun 1991 sekitar 28.000

sampel tumbuhan dari seluruh dunia telah dikoleksi karena memiliki aktivitas

antikanker. Sekitar 62% dari 87 jenis obat antikanker berasal dari bahan alam

(Cragg, 1993).

Hasil penelitian menunjukkan jenis buah-buahan dan sayuran segar

berpotensi preventif dan antikanker. Konsumsi sayur dan buah yang mengandung

flavonoid dapat menekan perkembangan kanker (Chatterjee, 1999). Apel kaya

akan serat dan flavonoid. Flavonoid apel tertinggi dibandingkan dengan jenis

buah-buahan lainnya. Flavonoid dilaporkan mampu menahan resiko terkena

kanker paru-paru sampai 50%. Penelitian Cornell University membuktikan bahwa

zat fitokimia yang terdapat dalam apel tersebut menghambat pertumbuhan sel

kanker usus sebesar 43%. Apel juga memiliki komponen fitokimia antikanker

seperti asam elegat, asam kafeat, asam klorogenat dan glutation. Asam elagat

berperan sebagai "obat" antikanker generasi baru, dengan kerja utama melindungi

kromosom dari kerusakan dan menghambat kerja dari banyak karsinogen, seperti

asap rokok (dikenal secara kolektif sebagai polycylic aromatic hydrocarbons dan

bahan-bahan kimia beracun seperti benzopyrene). Sementara glutation adalah

bahan antikanker penting yang menangkal efek racun dari logam berat, seperti

timah hitam. Zat tersebut juga dapat mengeliminasi pestisida dan bahan pelarut.

Selain apel, jeruk juga dilaporkan mengandung glutation (senyawa antikanker dan

antioksidan yang amat kuat) dengan kadar tinggi (Cooper, 1993).

Beberapa tumbuhan memiliki komponen antitumor berupa senyawa

fitokimia yang dikenal dengan pencegah kanker (cancer chemoprevention).

Pencegahan kanker menggunakan senyawa fitokimia adalah salah satu upaya

menggunakan bahan kimia alam yang diharapkan dapat mencegah tahap awal dari

suatu karsinogenesis, sebelum terjadi penyebaran lebih jauh. Senyawa antitumor

4

dan antikanker pada tanaman diantaranya indol isothiosianat, dithiolthion dan

organo sulfur yang banyak pada crucifera. Murakami et al, (1999) menyatakan

bahwa dari 107 species tanaman yang diuji sebagai antitumor berasal dari famili

Zingiberaceae dan Umbelliferae. Eksrak lengkuas mengandung ACA (1asetoksi

khavikol asetat). Kandungan tertinggi pada eksrak etil asetat dengan waktu

maserasi 48 jam sekitar 1,62 0,02 %. Memiliki potensi mengambat semua jenis

alur sel kanker dan sel kanker primer manusia. Aktivitas antikanker ekstrak

lengkuas disebabkan oleh kemampuan ekstrak ini meningkatkan interferon-y

(INF-y) oleh alir sel kanker paru-paru, leukimia, melanoma primer, melanoma

metastase dan kanker serviks (Rusmarilin, 2003). Kandungan isoflavon terdapat

dalam tanaman sayuran, buah-buahan, padi-padian dan kacang-kacangan terutama

banyak pada kedelai. Geneistein pada dosis 37 mM mampu menghambat aktivitas

tirosin kinase, konsenterasi 20 mM menghambat proliferasi sel dan sel MCF-7

(sel kanker payudara). Daun, buah dan kulit batang tumbuhan mengandung

senyawa golongan flavonoid dan polifenol (Sarjono, 2004; Harborne, 1996).

Bioprospeksi dan eksplorasi tumbuhan yang berpotensi preventif kanker

dan antikanker perlu terus dilakukan mengingat penyakit kanker diperkirakan

prevelensinya akan terus meningkat di negara-negara berkembang termasuk

Indonesia. Sebagian besar bahan bioaktif farmasi atau produk jadinya sebagai obat

antioksidasi dan terapi kanker masih diimpor dan juga harganya sangat mahal.

Salah satu tanaman asli Indonesia yang diduga memiliki potensi anti

kanker adalah langsat (Lansium domesticum L.). Daun tanaman langsat

mengandung alkaloida, saponin, flavonoida dan polifenol. Secara empiris tanaman

ini telah digunakan masyarakat pedalaman Kalimantan dan Minahasa Utara

sebagai obat antimalaria, tumor dan kanker. Biji tanaman ini secara tradisional

telah digunakan untuk mengobati penyakit parasitologis malaria. Namun belum

ada laporan ilmiah pemanfaatan ekstrak bagian tanaman ini sebagai obat

antikanker. Kearifan budaya etnomedikal masyarakat Indonesia yang diperoleh

turun temurun perlu dilestarikan dan dikembangkan sehingga dapat bermanfaat

bagi kesejahteraan manusia. Adanya kandungan alkaloid, flavonoid dan polifenol

lainnya pada tanaman langsat diduga berpotensi antikanker.

5

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fitokimia

yang memiliki potensi antioksidasi dan antikanker dari ekstrak kulit batang

langsat [L. domesticum L.] dan mengetahui aktivitas antioksidasi dan antikanker

ekstrak kulit batang langsat [L. domesticum L.] in vitro pada sel kanker murine

leukimia P388.

Dalam penelitian ini dirumuskan hipotesis bahwa terdapat senyawa

fitokimia yang bersifat antikanker dari ekstrak kulit batang langsat [L. domesticum

L.]. Senyawa tersebut memiliki aktivitas antioksidasi dan aktivitas antikanker

yang kuat. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang

aktivitas antioksidasi dan aktivitas antikanker ekstrak kulit batang langsat [L.

domesticum L.] dan juga diharapkan dapat meningkatkan nilai guna dan nilai

ekonomis tanaman.

TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Langsat

Tanaman langsat adalah tanaman buah yang cukup dikenal di Indonesia.

Tanaman ini dibudidayakan masyarakat dengan tujuan utama memanen buahnya

saja. Tanaman ini berhabitus pohon dengan tinggi sekitar 15-20 meter. Berakar

tunggang, batang berkayu, bulat, bercabang dan putih kotor. Daun majemuk, bulat

telur, ujung meruncing, pangkal runcing, panjang sekitar 20 cm, lebar 10 cm,

bertangkai dan berwarna hijau. Bunga majemuk, bentuk tandan pada batang dan

cabang, menggantung dengan panjang sekitar 10-30 cm. Buah buni, bulat,

berdiameter 2-4 cm, beruang lima, kuning kecoklatan. Rasa buah muda asam dan

bergetah dengan biji berwarna hijau dan berasa pahit. Kulit batang berasa lebih

pahit dibandingkan dengan biji (Simbala et al. 2004).

Dari segi kandungan fitokimia, belum banyak dilaporkan. Daun tumbuhan

ini diduga mengandung alkaloida, saponin, flavonoida dan polifenol. Biji langsat

telah dimanfaatkan masyarakat sebagai obat cacing, obat demam dan obat diare.

Menurut Simbala et al. (2004) tanaman langsat diklasifikasikan sebagai berikut:

Dunia : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Sapindales

Famili : Meliaceae

Genus : Lansium

Species : Lansium domesticum L.

Gambar 1 Batang, daun dan buah langsat (L. domesticum L.).

7

Radikal bebas

Radikal bebas adalah substansi reaktif yang dibentuk dalam sel-sel tubuh

sebagai hasil proses metabolisme. Pada tahun 1954 Gerschman dan timnya

pertama mengemukakan teori pembentukan radikal bebas. Radikal bebas adalah

molekul dengan satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbitalnya.

Banyak dari molekul ini adalah spesies oksigen. Radikal bebas oksigen dan

produk non radikalnya dikelompokkan dalam spesies oksigen reaktif (reactive

oxygen species (ROS)). Radikal bebas sangat reaktif, merupakan molekul yang

tidak stabil dan bereaksi dengan cepat pada biomolekul melalui banyak jenis

reaksi antara lain penangkapan hidrogen, donasi elektron dan penggunaan

elektron bersama. Radikal bebas akan melepaskan elektron pada molekul

sekitarnya untuk menghasilkan pasangan elektron agar menjadi molekul yang

stabil (Hosseinian, 2006 ; Maxwell & Lip, 1997).

ROS dihasilkan baik melalui faktor eksogen maupun endogen yang secara

langsung mempengaruhi kehidupan sel. Sumber penting radikal bebas dalam

tubuh dihasilkan oleh sistem enzim prooksidatif seperti lipooksigenase,

metabolisme obat, polutan, dan senyawa kimia asing bagi tubuh (xenobitotik). Di

dalam sel manusia, mitokondria menggunakan oksigen lebih dari 90%,

mitokondria menjadi sumber utama ROS dan radikal bebas. Sekitar 15% oksigen

yang digunakan oleh mitokondria direduksi dan dikonversi menjadi ROS. Reduksi

tetravalen oksigen dalam transpor elektron mitokondria sangat penting untuk

menghasilkan energi seluler, akan tetapi reduksi ini tidak seratus persen efesien,

sebagian membentuk radikal superoksida (O2*-). Radikal superoksida didismutasi

oleh superoksida dismutase membentuk H2O2. Substansi ini sangat oksidan,

interaksi dengan ion logam seperti Fe2+ dan Cu+ menghasilkan radikal hidroksil

yang sangat reaktif (OH*), akhirnya dapat menyebabkan banyak kerusakan

jaringan biologis (Young et al. 2002; Hosseinian, 2006; Maxwell & Lip, 1997).

Radikal bebas juga dapat menginisiasi reaksi berantai pembentukan ROS

pada asam lemak tak jenuh rantai panjang yang dikenal dengan reaksi peroksidasi

lipid. Peroksidasi lipid adalah reaksi propagasi yang menghasilkan radikal lipid

dan radikal peroksida. Asam lemak tak jenuh rantai panjang konstituen lipid

kompleks membran sel seperti fosfolipid dan lipoprotein menjadi target utama

8

inisiasi oleh radikal bebas pada reaksi peroksidasi lipid. Selama oksidasi lipid

akan terbentuk malondialdehid (MDA) yang dapat bereaksi dengan gugus amino

bebas pada protein, fosfolipid dan asam nukleat sehingga merusak struktur dan

fungsinya (Young et al. 2002; Maxwell & Lip, 1997).

ROS dapat dikelompokkan menjadi radikal oksigen dan kelompok derivat

non radikal oksigen. Kelompok radikal oksigen terdiri dari O2-(superoksid), HO2-

(hidroperoksil), OH-(hidroksil), L(R)OO-(peroksil) serta NO-(nitrit oksid)

sedangkan yang derivat non radikal oksigen antara lain ONOO- (peroksi nitrit),

-OCl (hipoklorit), 1-O2-(oksigen singlet), L(R)OOH (hidroperoksida) dan H2O2

(hidrogen peroksida) (Abuja & Albertini, 2001; Hosseinian, 2006).

Sasaran utama reaksi radikal bebas di dalam sel adalah ikatan-ikatan

rangkap dari lipida yang terdapat di dalam membran sel. Akibatnya fluiditas

membran akan berkurang dan sederetan reseptor selular akan berkurang. Serangan

radikal bebas juga dapat menimbulkan penumpukan kalsium dan lipofusin.

Radikal bebas dapat pula menjadikan enzim dan protein thiol (-SH) tidak aktif

dengan cara pembentukan ikatan silang maupun denaturasi. Akibatnya sintesis

dan degradasi protein terganggu. Jika radikal bebas menyerang asam-asam

nukleat akan menimbulkan gangguan terhadap molekul DNA yang berakibat

terbentuknya mutasi basa-basa nitrogen serta berakhir dengan pembentukan

karsinogenesis. ROS juga dapat menginduksi apoptosis, menggangu jalur signal

seluler, menggangu reaksi oksidasi reduksi sel dan meningkatkan kecepatan

mutasi DNA (Harliansyah, 2001; Valko et al. 2006).

Beberapa pembahasan mutahir tentang mekanisme terjadinya penyakit

degeneratif, mensinyalir bahwa stres oksidatif dan radikal bebas sangat

berpengaruh terhadap penyakit degeneratif dan kanker (Mc Cord, 2000). Interaksi

ROS dengan biomolekul dalam sel dijelaskan oleh Mates & Gomez (gambar 2).

9

Gambar 2 Interaksi spesies oksigen reaktif (ROS) terhadap biomolekul di dalam sel (Mates & Gomez 1999).

Antioksidan

Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda,

memperlambat dan mencegah proses oksidasi lipid walaupun dalam konsenterasi

yang sedikit (Sampels, 2005). Antioksidan adalah substansi yang diperlukan

tubuh untuk menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan

oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein dan lemak. Antioksidan

menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki

radikal bebas dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan

radikal bebas yang dapat menimbulkan stres oksidatif. Antioksidan dapat berperan

sebagai peredam radikal bebas (free radical scavenger), dekomposer peroksida,

mereduksi singlet oksigen dan menghambat enzim (Dean, 2003; Simpson, 2006).

ROS

Kerusakan oksidatif pada

protein

Stres oskidatif menginduksi

protein dan gen

Perubahan kimia pada basa nitrogen materi genetik

Menginduksi peroksidasi lipid

Perubahan konformasi DNA

Regulasi * pertumbuhan sel * diferensiasi sel * kematian sel oleh apoptosis dan nekrosis

Aktifasi dari : * transduksi sinyal * proliferasi sel

Penurunan efesiensi dari : * DNA polimerase * Repair DNA

Perluasan/peningkatan hot spot mutagenitas

Perubahan ikatan -H

Penghambatan dalam replikasi

Replikasi tidak akurat

MUTASI

10

Tubuh manusia memiliki aktivitas antioksidan endogenus. Enzim-enzim

antioksidan seperti superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT) dan glutation

peroksidase (GPX) berperan dalam meredam oksidan dan mencegah sel dari

kerusakan. Disamping enzim-enzim tersebut molekul non enzim dalam sel seperti

thioredoksin, thiol dan ikatan disulfida berperan dalam sistem pertahanan

antioksidan tubuh. Hasil studi epidemilogi mekanisme antioksidan endogenus ini

tidak mampu mengimbangi jumlah radikal bebas yang dihasilkan tubuh dan pada

kondisi tertentu aktivitasnya menjadi tidak efisien sehingga radikal bebas tersebut

menyebabkan kerusakan oksidatif pada biomolekul (Yang et al. 2007; Aqil et al.

2006; Mosquiera et al. 2007).

Ketidakseimbangan jumlah radikal bebas dan sistem antioksidan

endogenus menyebabkan terjadinya stres oksidatif. Untuk mencegah stres

oksidatif maka dibutuhkan antioksidan non enzimatis dari luar tubuh. Substansi

yang terkandung dari sayuran dan buah seperti -tokoferol, -karoten asam

askorbat, flavonoid dan senyawa fenolik, zink dan selenium termasuk dalam

kelompok antioksidan eksogenus (Simpson, 2006).

Sistem perlindungan dari dalam maupun dari luar tubuh sering tidak

memadai karena terlalu banyaknya radikal bebas yang terbentuk sebagai akibat

dari polusi udara, asap rokok, sinar ultra violet yang diproduksi sinar matahari,

pestisida dan senyawa xenobiotik di dalam makanan, bahkan olah raga yang

berlebihan. Zat pemicu yang diperlukan oleh tubuh untuk menghasilkan

antioksidan tidak cukup dikonsumsi. Kombinasi antara antioksidan dari luar

tubuh dan antioksidan dalam tubuh dapat menekan radikal bebas. Sebagai contoh,

tubuh manusia dapat menghasilkan glutation, salah satu antioksidan yang sangat

kuat, hanya saja tubuh memerlukan asupan vitamin C sebesar 1000 mg untuk

memicu tubuh menghasilkan glutation ini. Keseimbangan antara antioksidan dan

radikal bebas menjadi kunci utama pencegahan stres oksidatif dan penyakit-

penyakit kronis yang dihasilkannya. Keseimbangan antara antioksidan dan radikal

bebas diilustrasikan pada gambar 3.

11

Gambar 3 Keseimbangan radikal bebas-antioksidan mencegah stres oksidatif.

Aktivitas antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama merupakan

fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan

(AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan

primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal

lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan

radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal

lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat

laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai

autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Simpson,

2006; Harliansjah, 2007).

Penambahan antioksidan primer (AH) dengan konsentrasi rendah pada

lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak.

Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi

maupun propagasi. Radikal-radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi

tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi

dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru (Harliansjah, 2007).

Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipid adalah :

Inisiasi : R* + AH ----------> RH + A* radikal lipida antioksidan Propagasi : ROO* + AH ----------> ROOH + A*

Besarnya konsenterasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh

pada laju oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan golongan fenolik

sering lenyap bahkan antioksidan tersebut menjadi prooksidan. Pengaruh jumlah

konsentrasi pada laju oksidasi tergantung pada struktur antioksidan, kondisi dan

sampel yang akan diuji. Reaksi berikut menunjukkan antioksidan yang bertindak

12

sebagai prooksidan pada konsenterasi yang tinggi (Sampels, 2005; Harliansjah,

2007).

AH + O2 -----------> A* + HOO*

AH + ROOH ----------> RO* + H2O + A*

Telah diketahui mutasi gen dapat terjadi melalui mekanisme kesalahan

replikasi dan kesalahan genetik yang berkisar antara 10-15 %, atau faktor dari luar

yang merubah struktur DNA seperti virus, polusi, radiasi, dan senyawa xenobiotik

dari konsumsi pangan sebesar 80-85 %. Jadi jelas bahwa radikal bebas dan reaksi

oksidasi berantai yang dihasilkan besar pengaruhnya pada proses mutasi.

Kerusakan oksidatif DNA merupakan bagian dari karsinogenesis yang memberi

pengaruh sangat besar saat ini dengan banyaknya komponen xenobiotik pada

makanan yang membentuk radikal bebas dalam tubuh. Konsumsi antioksidan

alami dapat berperan sebagai biopreventif kanker (Silalahi, 2006; Harliansjah,

2007).

Senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami umumnya berasal

dari tumbuhan. Angiospermae memiliki kira-kira 250.000 sampai 300.000 spesies

dan dari jumlah ini kurang lebih 400 spesies yang telah dikenal dapat menjadi

bahan pangan manusia. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan

yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian yang dapat dimakan.

Antioksidan alami tersebar di beberapa bagian tanaman, seperti pada kayu, kulit

kayu, akar, daun, buah, bunga, biji dan serbuk sari (Mosquiera et al. 2007;

Harliansjah, 2007).

Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik

atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat,

kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Sementara turunan

asam sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-

lain. Jahe (Zingiber officinale Roscoe.) biasa digunakan sebagai bumbu atau obat

tradisional. Komponen-komponen pedas dari jahe seperti 6 gingerol dan 6-

shogaol dikenal memiliki aktivitas antioksidan yang cukup kuat. Dari ekstrak jahe

yang telah dibuang komponen volatilnya dengan destilasi uap, maka dari fraksi

non volatilnya setelah pemurnian, ditemukan adanya empat senyawa turunan

13

gingerol dan empat macam diarilheptanoid yang memiliki aktivitas antioksidan

kuat (Harliansjah, 2007).

Ada beberapa senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan telah

berhasil diisolasi dari kedelai (Glycine max L.), salah satunya adalah flavonoid.

Flavonoid kedelai unik dimana dari semua flavonoid yang terisolasi dan

teridentifikasi adalah isoflavon. Pada dosis 2,24 mg/0,2 ml isolat flavonoid dari

herba benalu mangga mampu menghambat pertumbuhan kanker pada hewan uji

mencit. Senyawa flavonoid dari benalu adalah senyawa kuersetin yang bersifat

inhibitor terhadap enzim DNA topoisomerase I sel kanker (Sukardiman et al.

1995).

Flavonoid yang terdapat pada buah-buahan dan sayuran memberi

pengaruh yang menguntungkan dan sebagai antioksidan. Antioksidan dari

flavonoid tergantung pada struktur molekulnya. Flavonoid adalah substansi

polifenolik yang banyak terdapat pada tumbuhan; berdasarkan struktur kimia yang

termasuk dalam golongan flavonoid adalah flavonol, flavon, flavanon, isoflavon,

katekin, antosianidin dan kalkon. Sekitar 4000 flavonoid telah diidentifikasi

banyak yang berasal dari sayuran, buah, teh, kopi, bir, wine dan minuman sari

buah. Secara epidemologi konsumsi sayur dan buah segar secara rutin menekan

resiko kanker dan penyakit degeneratif akibat spesies radikal bebas. Konsumsi

sayuran, buah dan ramuan obat herbal yang kaya kandungan flavonoid menekan

resiko terserang penyakit jantung dan kanker (Buhler & Miranda, 2000; Okawa et

al. 2001).

Kanker

Kanker dianggap suatu kelompok penyakit seluler dan genetik karena

dimulai dari satu sel yang telah mengalami mutasi DNA sebagai komponen dasar

gen. Sel-sel yang mengalami kerusakan genetik tidak peka lagi terhadap

mekanisme regulasi siklus sel normal sehingga akan terus melakukan proliferasi

tanpa kontrol (Silalahi, 2006). Kerusakan dalam struktur DNA dapat berakibat

pertumbuhan sel yang tidak terkendali yang dikenal dengan penyakit kanker.

Banyak faktor penyebab terjadinya kanker, faktor internal terutama

keberadaan gen-gen yang berperan pada siklus sel telah menjadi pusat perhatian

14

dalam hubungan dengan proses terjadinya tumor. Mutasi yang terjadi pada DNA

di dalam gen yang meregulasi siklus sel (pertumbuhan, kematian dan

pemeliharaan sel) akan menyebabkan penyimpangan siklus sel, dan salah satu

akibatnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis. Ada tiga cara atau

faktor penting dalam proses terjadinya mutasi gen yaitu: (1) faktor lingkungan

yang meliputi nutrisi, agen infektor, gaya hidup; (2) faktor kebetulan, dan (3)

faktor keturunan atau bawaan (Silalahi, 2006).

Gambar 4 Mutasi dan proses perkembangan kanker hati (Ren et al. 2003)

Karsinogenesis atau proses perkembangan pembentukan kanker terdiri atas

tiga tahapan yaitu inisiasi, promosi dan progresi. Tahap inisiasi ditandai dengan

perubahan permanen pada sel. Inisiasi ini disebabkan oleh agen karsinogen baik

endogen maupun eksogen yang menyebabkan perubahan sel-sel di jaringan,

penghambatan metabolisme DNA yang menyebabkan terjadinya perubahan

susunan DNA sel awal atau disebut mutasi (Pitot & Dragan, 1991). Agen-agen

karsinogen ditunjukan pada tabel 1.

Sel sehat

Kerusakan pada sel

Akumulasi kesalahan genetik

Sel yang tidak sehat mengalami pembelahan dengan cepat dan menjadi sel kan ker

Liver sehat

Kanker Hati

15

Tabel 1 Klasifikasi umum agen Karsinogenik (Pitot & Dragan, 1991). Kelas Contoh Massa relatif molekuler (dalton)

I. Kimia Hidrokarbon polisiklik, amina dan halida aromatik, hormon, logam dan polimer permukaan

5 x 10 5 x 104

II. Radiasi Ionisasi ( sinar x, gama, partikel radiasi) dan radiasi ultraviolet

16

1 2 3

A.

1 2 3

B.

Gambar 5 Tipe progresi tumor (Pitot & Dragan, 1991)

Gambar A, model genetik dari progresi kanker manusia. Tumor dapat

dibagi menjadi 3 kelompok yaitu lesi prakanker, karsinoma dam metastasis. Lesi

prakanker tidak dapat dideteksi secara klinis. Pada gambar A progresi tumor

dengan lesi prakanker. Pada gambar B progresi tumor tanpa lesi prakanker.

Kejadian genetik ditunjukkan dengan nomor 1-3. Walaupun jumlah kejadian

genetik minimum terjadi pada konversi sel normal menjadi karsinoma belum

banyak diketahui, beberapa bukti menyatakan bahwa dua gen yaitu RB dan p53

berperan dalam represi sel kanker (Yakota & Sugimura, 1993).

Ada tiga kelompok utama gen yang terlibat dalam regulasi pertumbuhan

sel yaitu proto-onkogen, gen penekan tumor (tumor suppresor gene (TSG)) dan

gen penjaga (gatekeeper gene). Proto-onkogen menstimulasi dan meregulasi

pertumbuhan dan pembelahan sel. Gen penekan tumor biasanya menghambat

pertumbuhan sel atau menginduksi apoptosis. Kelompok gen ini dikenal sebagai

anti-onkogen, karena berfungsi melakukan kontrol negatif (penekanan) pada

pertumbuhan sel. Gen p53 merupakan salah satu dari TSG yang menyandi protein

penekan tumor dengan berat molekul 53 kDa. Gen p53 juga berfungsi mendeteksi

kerusakan DNA, menginduksi reparasi DNA. Gen penjaga berfungsi

mempertahankan integritas genomik dengan mendeteksi kesalahan pada genom

dan memperbaikinya. Mutasi pada gen-gen ini karena berbagai faktor membuka

peluang terbentuknya kanker (Mc Kelvery, et al. 2003; Gondhowiarjo, 2004).

Pada keadaan normal, pertumbuhan sel akan terjadi sesuai dengan

kebutuhan melalui siklus sel normal yang dikendalikan secara terpadu oleh fungsi

ketiga gen yaitu proto-onkogen, gen penekan tumor dan gen penjaga secara

seimbang. Jika terjadi ketidakseimbangan fungsi ketiga gen ini, atau salah satu

tidak berfungsi dengan baik karena mutasi, maka keadaan ini akan menyebabkan

Sel normal Lesi prakanker Metastasis Karsinoma

Sel normal Fenotipe normal Metastasis Karsinoma

17

penyimpangan siklus sel. Pertumbuhan sel tidak normal pada proses terbentuknya

kanker dapat terjadi melalui tiga mekanisme yaitu perpendekan waktu siklus sel,

sehingga akan menghasilkan lebih banyak sel dalam satuan waktu tertentu,

penurunan jumlah kematian sel akibat gangguan proses apoptosis, dan masuknya

kembali populasi sel yang tidak aktif berproliferasi ke dalam siklus proliferasi.

Sebagai contoh pada kondisi TSG kurang aktif atau proto-onkogen terlalu aktif.

Gabungan mutasi dari ketiga kelompok gen ini akan menyebabkan kelainan siklus

sel, yang sering terjadi adalah mutasi gen yang berperan dalam mekanisme

kontrol sehingga tidak berfungsi baik, akibatnya sel akan berkembang tanpa

kontrol (yang sering terjadi pada manusia adalah mutasi gen p53). Akhirnya akan

terjadi pertumbuhan sel yang tidak diperlukan, tanpa kendali dan karsinogenesis

dimulai (McKelvery, et al. 2003; Gondhowiarjo, 2004, Walker & Blackburn,

2004).

RB dan dan gen p53 adalah dua dari banyak target perubahan genetik pada

kanker manusia. Hasil kajian beberapa tahun terakhir ini menunjukkan bahwa

mekanisme biokimia dari gen-gen ini berperan sebagai tumor supressor. Gen p53

adalah monitor signal biokimia dalam sel yang dapat mengindikasikan kerusakan

DNA atau mutasi. Produk gen p53 adalah hasil dari transkripsi multifaktor yang

meregulasi induksi apoptosis dalam sel dalam perusakan DNA, dengan demikian

mencegah propagasi kerusakan DNA sel lain. Lebih dari 50% tumor pada

manusia, termasuk jenis-jenis sarkoma mengalami mutasi pada gen p53 (Nambiar,

et al. 2001). Pada deteksi perkembangan kanker, protein p53 membangun diri

dalam nukleus sel, mengarahkan sel pada penghentian pertumbuhan atau

penghancuran diri. Tetapi pada kondisi normal, sel tidak membutuhkan ekspresi

gen p53. Kenyataannya adanya protein p53 dalam nukleus akan menghambat

pertumbuhan sel normal. Gen p53 akan dikirim dari nukleus ke sitoplasma untuk

degradasi. Pada saat kerusakan DNA terjadi, fosfat melekat pada protein p53,

mencegah p53 meninggalkan nukleus sehingga terakumulasi di nukleus. Setengah

dari sel-sel tumor tidak ditemukan aktivitas p53, hal ini dapat disebabkan oleh gen

kinase yang bertanggung jawab untuk fosforilasi termutasi. Ketika gen ini rusak,

kerusakan DNA tidak dapat diperbaiki karena p53 terus dikirim ke sitoplasma dan

didegradasi di sana (Franzen, 2001).

18

Gen p53 dapat mengalami modifikasi jika diserang oleh gugus kimia

tertentu. Pada kondisi tertentu, protein p53 sangat tidak stabil dan ditemukan

dalam jumlah sangat sedikit dalam sel. Tetapi pada saat sel mengarah pada

kerusakan DNA, dengan perlahan di degradasi p53, sehingga protein p53 akan

meningkat dan berperan melindungi. Pada saat kandungan p53 lebih tinggi dari

normal berperan sebagai supresor tumor, berikatan dengan banyak sisi regulasi

dalam sel genom untuk mengaktifasi produksi protein lain yang dapat

menghentikan pembelahan sel jika DNA yang rusak dapat diperbaiki. Apabila

kerusakan terlampau besar sehingga tidak dapat direpair, protein ini akan

mengarahkan pada program kematian sel (apoptosis) (SIBS, 2005).

Faktor lingkungan seperti gaya hidup dan pola makan berkorelasi dengan

insiden kanker misalnya paparan sinar ultraviolet dengan kanker kulit, merokok

dengan kanker paru-paru. Tetapi tidak semua perokok akan mengidap kanker

paru-paru atau berjemur akan selalu menderita kanker kulit; berarti ada faktor lain

di luar faktor lingkungan yakni kesalahan replikasi DNA dan bawaan

(McKelvery, et al. 2003; Go, et al. 2003; Milner, 2004, dan Nowell, et al. 2004).

Adanya faktor kebetulan dapat diterangkan sebagai berikut. Tubuh

mengadakan replikasi DNA secara akurat, tetapi masih terjadi kesalahan satu kali

dari 10 juta pasangan basa. Kemudian 99,9% dari yang salah dalam replikasi,

dikoreksi dan diperbaiki, berarti replikasi DNA yang salah masih ada tersisa. Di

samping itu, proses metabolisme normal dalam tubuh menghasilkan radikal bebas

yang reaktif dan menimbulkan kerusakan oksidatif terhadap DNA secara terus-

menerus. Kanker dapat terjadi akibat akumulasi DNA termutasi dalam gen

terutama yang mengatur proses siklus dan pertumbuhan sel. Mekanisme ke tiga

cara terjadinya mutasi DNA adalah melalui faktor keturunan atau bawaan, yang

menyebabkan 5-10% kanker. Mutasi yang terjadi pada DNA di dalam gen yang

meregulasi siklus sel akan mengakibatkan penyimpangan, dan salah satu dampak

negatifnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis (McKelvery, et al.

2003; Silalahi, 2006).

Seperti telah dijelaskan sebelumnya karsinogenesis berlangsung lama dan

dibagi tiga tahap yakni inisiasi, promosi dan progresi. Pada tahap inisiasi sudah

terjadi perubahan permanen di dalam genom sel akibat kerusakan DNA yang

19

berakhir pada mutagenesis. Sel yang telah berubah ini tumbuh lebih cepat

dibandingkan dengan sel normal di sekitarnya. Pada tahap ini proses mutasi akan

mengaktivasi atau menghambat proto-onkogen.

Faktor yang mengubah fungsi proto-onkogen dan TSG antara lain adalah

karsinogen yang mengubah struktur DNA, radiasi yang memicu pembentukan

spesies kimia reaktif dan radikal bebas, dan virus. Tahap inisiasi berlangsung

dalam satu sampai beberapa hari. Tahap promosi berlangsung lama bisa lebih dari

sepuluh tahun. Suatu proses panjang yang disebabkan oleh kerusakan yang

melekat dalam materi genetik di dalam sel. Melalui mekanisme epigenetik akan

terjadi ekspansi sel-sel rusak membentuk premalignansi dari populasi multiseluler

tumor yang melakukan proliferasi (Lee, et al. 2004).

Senyawa-senyawa yang merangsang pembelahan sel disebut promotor

atau epigenetik karsinogen. Pada tahap perkembangan (progression), terjadi insta-

bilitas genetik yang menyebabkan perubahan-perubahan mutagenik dan

epigenetik. Proses ini akan menghasilkan klon baru sel-sel tumor yang memiliki

aktivitas proliferasi, bersifat invasif (menyerang) dan potensi metastatiknya

meningkat. Selama tahapan ini, sel-sel malignan berkembang biak menyerbu

jaringan sekitar, menyebar ke tempat lain. Jika tidak ada yang menghalangi

pertumbuhannya, akan terbentuk dalam jumlah yang cukup besar untuk

mempengaruhi fungsi tubuh, dan gejala-gejala kanker muncul. Tahap terakhir ini

berlangsung selama lebih dari satu tahun, sehingga seluruh karsinogenesis dapat

berlangsung selama dua puluh tahun (Silalahi, 2003). Insiden kanker pada orang

yang lebih tua lebih tinggi daripada orang muda karena perubahan DNA akibat

paparan lingkungan berisiko dan kesempatan akumulasi yang lebih besar seiring

dengan bertambahnya usia, oleh karena itu jika timbul kanker pada usia muda

patut diselidiki adanya faktor keturunan. Pengenalan lebih dini risiko kanker pada

satu keluarga sangat penting untuk manajemen pencegahan dan terapi

(McKelvery, et al. 2003; Silalahi, 2006).

Kemajuan di bidang genetik tidak hanya meningkatkan pemahaman

tentang keterkaitan gen dengan penyakit tetapi juga membuka kesempatan yang

lebih luas untuk meneliti kerentanan genetik. Tes genetik meliputi analisis DNA,

RNA, kromosom, protein, dan metabolit dapat meramalkan atau mendeteksi

20

penyakit. Tes ini biasanya dilakukan terhadap DNA dan kromosom yang diisolasi

dari sampel darah atau sel tumor (Keku et al, 2003).

Kanker dapat menyebabkan banyak gejala yang berbeda, bergantung pada

lokasinya dan karakter dari keganasan dan apakah ada metastasis. Sebuah

diagnosis yang menentukan biasanya membutuhkan pemeriksaan mikroskopik

jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah didiagnosis, penderita kanker

biasanya dirawat dengan operasi, kemoterapi dan atau radiasi.

Pengobatan kanker yang umum dilakukan saat ini adalah dengan cara

kemoterapi. Kemoterapi adalah terapi kimia dengan menggunakan zat-zat

kemoterapi untuk menekan pertumbuhan kanker. Zat-zat kimia yang digunakan

dapat dari hasil sintesis kimia, semisintetik, fitokimia, bioaktif hewan dan dari

mikroorganisme.

Metode kemoterapi dilakukan dengan cara memberikan obat dalam bentuk

senyawa kimia untuk membunuh sel-sel kanker dalam tubuh pasien. Kemoterapi

dapat diberikan melalui mulut atau injeksi, kadang-kadang dapat juga langsung

pada bagian tubuh yang terkena kanker. Kebanyakan kemoterapi diberikan secara

infus melalui pembuluh darah vena. Namun, teknik kemoterapi di samping

membunuh sel-sel kanker juga dapat mengakibatkan rusaknya sel-sel normal yang

kebetulan menyerap obat tersebut. Efek samping pengobatan ini cukup berat,

misalnya mual, muntah, rambut rontok, dan lain-lain.

Operasi bedah merupakan pilihan efektif untuk tipe kanker yang tidak

terikat erat pada jaringan tubuh lainnya, serta sel-sel kankernya terbungkus dalam

satu kesatuan. Namun, teknik pembedahan ini menjadi kurang menguntungkan

pada jenis kanker terbuka, karena dapat meninggalkan sisa-sisa sel kanker yang

dapat tumbuh kembali di kemudian hari. Teknik operasi bedah juga tidak dapat

digunakan untuk jenis kanker yang sudah bermetastasis. Saat ini dengan mahalnya

obat kemoterapi sintetik dan meningkatnya kasus penyakit kanker maka

pengobatan kanker difokuskan pada komponen fitokimia dan bioaktif dari

mikroba dan hewan yang berpotensi menekan pertumbuhan sel normal atau reaksi

metabolik.

Sekitar 400 spesies tanaman dalam 315 genus dan 97 famili mempunyai

aktivitas sebagai penghambat tumor (Farnsworth, 1996). Berbagai zat fitokimia

21

yang berkhasiat sebagai antikanker dari beberapa tanaman telah berhasil diisolasi

oleh Mc Laughlin dkk, dimana pencarian senyawa bioaktif tersebut dilakukan

setelah dalam praskrining aktivitas terhadap ekstrak tanaman menunjukkan hasil

positif atau aktif (Mc Laughlin, 1991). Saat ini teridentifikasi ada sekitar 400 ribu

tumbuhan obat, 60% diantaranya berpotensi sebagai antikanker; 75% berpotensi

antiinfeksi. Sekitar 107 spesies tanaman yang diuji sebagai antitumor berasal dari

famili zingiberaceae dan umbelliferae (Murakami et al. 1999).

Tumbuhan memiliki komponen pencegah tumor berupa senyawa fitokimia

atau dikenal dengan cancer chemoprevention. Pencegahan kanker menggunakan

senyawa fitokimia adalah salah satu upaya menggunakan bahan kimia alam yang

diharapkan dapat mencegah tahap awal dari suatu karsinogenesis, sebelum terjadi

penyebaran lebih jauh. Senyawa kanker pada tanaman diantaranya indol

isothiosianat, dithiolthion dan organo sulfur yang banyak pada crucifera

(Rusmarilin, 2003).

Tabel 2 Flavonoid Antikanker Jenis Kanker Sel Jenis Flavonoid

Kanker mulut HSC-2, HSG, SCC-25 Flavanon, isoflavon, EGC, chalcones, EGCG, curcumin, genistein, ECG, quercetin, cisplatin.

Kanker payudara MCF-7 Flavanon, daidzein, genistein, quercetin, luteolin.

Kanker tiroid ARO, NPA, WRO Genistein, apigenin, kaempfrol, chrysin, luteolin, biochanin A

Kanker Paru-paru SK-LU1, SW900, H441, H661, haGo-K-1, A549

Flavon, quercetin.

Kanker Prostat LNCaP, PC3, DU145

Catechin, epicatechin, quercetin, kaempferol, luteolin, genistein, apigenin, myricetin, ilymarin.

Kanker Usus Caco-2, HT-29, IEC-6, HCT-15 Flavon, quercetin, genistein, anthocyanin.

Leukimia HL-60, K562, Jurkat Apigenin, quercetin, myricetin, chalcones. Melanoma Mencit B16 4A5 Chalcones Sumber: Ren et al. 2003.

Indonesia adalah negara dengan biodiversitas flora dan fauna terbesar

kedua setelah Brasil. Tidak heran banyak peneliti datang mengkaji flora dan fauna

tumbuhan di Indonesia yang berpotensi obat: antibakteri, antidiabetes,

antihiperlipidemia dll, baik secara legal maupun ilegal. Banyak prekursor obat

antikanker berasal dari tumbuhan antara lain Podophyllootoxin dari Podophyllum

22

hexandrum sebagai prekursor obat kanker etoposide, teniposide dan etopophose

(Farkya, et al. 2007). Homoharringtonine (Ceflatonin) alkaloid yang diisolasi dari

Cephalotaxus harringtonia sebagai obat antikanker yang telah memiliki merek

dagang. Aktivitas Ceflatonin sebagai inhibitor sintesis protein. Phenoxodiol

adalah derivat dari isoflavon dan daidzein diisolasi dari kacang-kacangan berperan

sebagai inhibitor NADH oksidase (Williams, 2005).

Ceflatonin Phenoxodiol

Gambar 6 Obat antikanker yang berasal dari tumbuhan dan telah memiliki merek dagang.

Beberapa penelitian yang melaporkan potensi fitokimia tumbuhan sebagai

obat antikanker adalah :

1. Kunyit dapat mencegah kanker usus dengan cara menginhibisi enzim-enzim

lipid peroksidase dan siklooksigenase-2 yang merupakan implikasi

perkembangan kanker dan menginduksi enzim glutation-S-transferase. Induksi

siklooksigenase-2 dihubungkan dengan produksi prostaglandin (hormon

pengatur gerakan otot). Kunyit juga menunjukkan aktivitas sebagai

antioksidan yang dihubungkan dengan mekanisme pemadaman singlet O2 yang dapat merusak DNA, namun sifat antioksidan ini bukan sebagai

penghambatan superoksida anion atau radikal bebas hidroxil (Didinkaem,

2007).

2. Daun Eupatorium triplinerve Vahl. Ekstrak heksana daun E. triplinerve Vahl.

mempunyai aktivitas hambatan pertumbuhan terhadap kultur sel mieloma

dengan metode viabilitas sel dengan nilai ED50 = 5,85 g/ml (Hidayat, 2002). 3. Kulit batang sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.) Ekstrak aseton dan n-heksana

dari kulit batang sesoot, mempunyai efek anti-mutagenik terhadap mutagen

standar sehingga sangat potensial untuk dikembangkan sebagai antikanker.

23

4. Katekin dan polifenol dari ekstrak teh hijau menunjukkan aktivitas antikanker

yang kuat (Colic & Pavelic, 2004).

5. Eksrak lengkuas mengandung ACA= 1asetoksi khavikol asetat. Kandungan

tertinggi pada eksrak etil asetat dengan waktu maserasi 48 jam sekitar 1,62 +-

0,02%. Memiliki potensi menghambat semua jenis alur sel kanker dan sel

kanker primer manusia. Aktivitas antikanker ekstrak lengkuas disebabkan oleh

kemampuan ekstrak ini meningkatkan INF-y oleh alir sel kanker paru-paru,

leukimia, melanoma primer, melanoma matastase dan kanker serviks

(Rusmarilin, 2003).

Dalam pencarian bahan bioaktif yang mempunyai aktivitas antikanker

digunakan beberapa metode skrining aktivitas biologis sebagai berikut: (i) Uji

kematian larva udang laut (Brine shrimp lethality test (BSLT)), (ii) Uji hambatan

tumor pada lempeng kentang (Potato disc crow gall tumor inhibition assay), (iii)

Uji proliferasi kuncup lemna (Lemna frond proliferation assay), (iv) Uji sitotoksik

in vitro dan in vivo (Hidayat, 2002).

Dalam kajian penemuan obat antikanker, banyak sistem bioassay yang

telah diketahui. Secara in vitro dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu pengujian

seluler (cellular assays) dan pengujian mekanisme (molecular assays). Pengujian

seluler juga dapat dibagi menjadi pengujian sitotoksisitas dan pengujian morfologi

sel. Contoh dari pengujian sitotoksisitas adalah mengukur konsenterasi sampel

yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50% dalam kultur

sel tunggal (single cell line). Pada tahun 1956 NCI menseleksi L1210 (leukimia

tikus) sebagai screen utama dan kemudian pada tahun 1971 digantikan oleh P388

(lymphocystic leukimia) untuk pengujian in vitro antikanker. Kultur sel ini lebih

sensitif dibandingkan L1210 tetapi memiliki karakteristik yang mirip. Pertama

kali digunakan untuk skrining pada tahun 1985. Karena sitotoksisitas konsisten

maka sitotoksisitas menjadi bioassay yang memiliki keuntungan utama yaitu

semua mekanisme potensial pada proliferasi seluler dapat dimonitoring secara

simultan (Suffness, 1987).

Beberapa penelitian in vivo aktivitas antikanker senyawa fitokimia

tumbuhan antara lain dilakukan oleh Munim, et al. (2001) melakukan uji

tumorigenesis pada sari buah merah (Pandanus conoideus Lam.) dengan

24

menggunakan tikus putih (Ratus novergicus) galur Sprague-Dawley yang berumur

lima minggu dengan berat 100-150 gram yang diinduksi dengan DMBA (7,12

dimetilbenz(a)antrasen). Tikus dibagi dalam beberapa kelompok yaitu kelompok

kontrol, kelompok perlakuan dengan berbagai konsenterasi sari buah merah dan

kontrol normal yang hanya diberi 1 ml minyak wijen. Pengamatan aktivitas

dilakukan dengan melihat kerusakan histologi paru-paru.

Sukardiman et al. 1995, melakukan penelitian efek antikanker isolat

flavonoid dari herba benalu Mangga (Dendrophtoe petandra). Bioassay yang

digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih betina galur BALB-C, berusia

sekitar dua bulan. Kanker dibuat dengan menyuntikkan larutan benzopirena dalam

oleum olivarum secara subkutan pada daerah interskapuler (tengkuk) dengan dosis

0,3 mg/0,l ml selama 10 kali dengan interval 2 hari sekali. Benjolan kanker pada

mencit akan mulai tumbuh dua bulan setelah penyuntikan benzopirena. Hewan

coba dibagi dalam 4 kelompok yang masing-masing terdiri dari lima ekor mencit:

(1). Kelompok kontrol (tanpa pemberian isolat flavonoid) (2). Kelompok yang

diberi flavonoid dengan dosis 0,56 mg/0,2 ml (3). Kelompok yang diberi

flavonoid dengan dosis 1,12 mg/ 0,2 ml (4). Kelompok yang diberi flavonoid

dengan dosis 2,24 mg/ 0,2 ml. Pada dosis 2,44 mg/0,2 ml, isolat flavonoid herba

benalu mangga (D. petandra) mampu menghambat pertumbuhan kanker pada

mencit (p < 0,05).

25

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2007 sampai dengan

Januari 2008. Ekstraksi kulit batang langsat, analisis fitokimia, uji toksisitas

metode BSLT dan uji antioksidasi dilaksanakan di Pusat Studi Biofarmaka IPB

Bogor. Uji in vitro antikanker pada sel murine leukimia P388 dilaksanakan di

Laboratorium Kimia Bahan Alam ITB Bandung.

Bahan dan Alat

Sampel kulit batang pohon langsat (Lansium domesticum L.) diperoleh

dari perkebunan rakyat di Minahasa Utara dan Arboretum Jurusan Biologi FMIPA

UNIMA yang telah dideterminasi. Sampel kulit batang basah adalah sampel kulit

batang langsat tanpa perlakuan pengeringan sedangkan sampel kulit batang kering

adalah kulit batang langsat dengan kadar air 10%.

Ekstraksi. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 70% , kloroform, air

bebas ion. Alat yang digunakan adalah oven, penggiling, blender, neraca analitik,

labu ukur, corong pisah, labu bulat, rotavapor dan erlenmeyer.

Analisis fitokimia. Bahan kimia yang digunakan pareaksi Dragendorff,

pareaksi Mayers, pareaksi Wagner, etanol 95%, HCL, logam Mg, Na2CO3, FeCl3,

H2SO4 dan anhidrida asetat. Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, rak tabung

reaksi, gelas ukur, erlenmeyer, pengaduk, hot plate dan neraca analitik.

Uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).

Bahan dan alat yang digunakan antara lain larva udang (Artemia salina Leach.),

aerator, wadah penetasan, erlenmenyer, timbangan analitik, lup, lampu, perangkat

vial uji dan mikropipet.

Uji aktivitas antioksidasi. Bahan yang digunakan antara lain ekstrak kulit

batang langsat, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), butil hidroksi toluena (BHT),

NaOH 10%, asam asetat anhidrida, kertas saring, air bebas ion, etanol 75%, etanol

absolut, asam linoleat (sigma aldrich), buffer fosfat 0.1 M pH 7, Fe CL2.4H2O,

HCL, amonium tiosianat, -tokoferol (sigma aldrich), 1,1,3,3-tetrametoksipropana

(TMP) 6 M, asam tiobarbiturat (TBA), asam asetat 50% dan asam trikloroasetat

26

(TCA) 20%. Alat yang digunakan adalah botol gelap berulir berpenutup, tabung

reaksi, gelas ukur, inkubator, pH indikator, sentrifuse model 800 dan

spektrofotometer UV-Vis U-2800 Hitachi.

Uji aktivitas antikanker. Bahan yang digunakan adalah sel kanker murine

leukimia P388 dari Laboratorium Kimia Bahan Alam ITB, media Rosewell Park

Memorial Institute (RPMI) 1640, serum fetal bovine, kanamisin, reagen pewarna

[3-(4,5-dimetil thiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolium bromida], larutan 10% SDS-

0,01 N HCL. Alat yang digunakan adalah microplate 550 nm, inkubator CO2 perangkat sumur kultur, mikropipet, microplate reader dan alat-alat gelas.

Diagram Alir Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dalam lima tahap yaitu pertama ekstraksi kulit

batang langsat, kedua analisis fitokimia, ketiga uji toksisitas ekstrak etanol dengan

metode BSLT, keempat uji aktivitas antioksidasi ekstrak kasar dengan dua metode

yaitu metode DPPH dan metode TBA dan terakhir uji aktivitas antikanker in vitro

metode sitotoksik pada sel murine leukimia P388 (gambar 7).

Gambar 7 Diagram alir penelitian

Ekstraksi kulit batang L. domesticum L. (Harborne, 1996)

Bahan tanaman yang digunakan yaitu kulit batang langsat [L. domesticum

L.] basah (KBLB) dan kering (KBLK) yang dibersihkan. Kulit batang langsat

Ekstraksi Kulit Batang L. domesticum L.

Analisis fitokimia

Uji toksisitas metode BSLT

Uji aktivitas antioksidasi

Uji aktivitas antikanker

27

basah diblender sampai halus sedangkan untuk kulit batang kering dihaluskan

dengan mesin penggiling dan diayak dengan saringan berukuran 100 mesh.

Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Dimasukkan sebanyak 40 g

serbuk kulit batang kering ke dalam erlenmeyer, tuangi pelarut etanol 70%

sebanyak 250 ml kemudian ditutup rapat sambil sesekali digoyang selama 24 jam.

Saring dengan kertas saring Buchner. Diperoleh filtrat (F1) dan residu. Residu

diekstraksi kembali dengan kloroform:air 1:1 diperoleh filtrat (F2) dan residu.

Dengan cara yang sama dilakukan pada kulit batang basah sehingga hasil akhirnya

diperoleh F1, F2, F3 dan F4. Masing-masing filtrat di rotapavor atau dibeku

keringkan dengan alat freeze dryer sehingga diperoleh ekstrak kasar (lampiran 3).

Analisis fitokimia (Harborne 1996)

Uji alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 3 mL kloroform

dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes

H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil, kemudian ditambahkan pareaksi Meyer dan

Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih oleh

pareaksi Meyer dan endapan coklat oleh pareaksi Wegner. Sebagai pembanding

gunakan tapak darah.

Uji Saponin dan Flavonoid. Sebanyak 1 gram ekstrak dimasukkan

dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan didihkan selama 5

menit, setelah itu disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Uji saponin

dilakukan dengan pengocokkan 10 ml filtrat dalam tabung reaksi tertutup selama

10 detik kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan

dengan terbentuknya buih/busa yang stabil.

Sebanyak 10 ml filtrat yang lain ditambahkan 0.5 gram serbuk

magnesium, 2ml alkohol karbohidrat (campuran HCL 37% dan etanol 95%

dengan perbandingan 1:1) dan 20 ml amil alkohol kemudian dikocok kuat.

Terbentuknya warna merah, kuning dan jingga pada lapisan amil alkohol

menunjukkan adanya flavonoid.

Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 2 mL air kemudian

dididihkan selama beberapa menit. Lalu disaring dan filtratnya ditambah 1 tetes

FeCl3 1 % (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin.

28

Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambah 2 mL

etanol 30 % lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambah

eter 1:1. Lapisan eter ditambah pareaksi Lieberman Burchard ( 3 tetes asam asetat

anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah dan warna hijau menunjukkan

adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid.

Uji toksisitas ekstrak terhadap A. salina Leach (Mc Laughlin et al, 1998)

Penetasan kista A. salina Leach. Kista A. salina Leach ditimbang

sebanyak 20 mg kemudian dimasukkan ke dalam wadah khusus yang berisi air

laut yang sudah disaring, setelah diaerasi kista dibiarkan selama 48 jam dibawah

pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Larva yang sudah menetas diambil

untuk digunakan dalam uji toksisitas.

Uji toksisitas terhadap A. salina Leach. Sebanyak 10 ekor larva A. Salina

Leach yang sehat (berdasarkan motilitas dan kemampuan larva mencari cahaya)

dimasukkan ke dalam vial uji yang berisi air laut. Tambahkan larutan ekstrak

etanol KBLB dan KBLK pada masing-masing vial uji dengan konsenterasi larutan

uji terdiri atas 10, 100, 500 dan 1000 ppm sedangkan untuk kontrol tidak

ditambahkan larutan ekstrak. Masing-masing dibuat tiga ulangan. Pengamatan

dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva yang mati dari total

larva yang dimasukkan dalam vial uji. Penghitungan memakai bantuan kaca

pembesar. Pengolahan data persen mortalitas kumulatif digunakan analisis probit

LC50 dengan selang kepercayaan 95% pada program Minitab 14.

Uji aktivitas antioksidasi

Pengujian aktivitas antioksidasi dilakukan dengan 2 cara, yaitu metode

DPPH dan metode asam tiobutirat (TBA).

1. Metode DPPH

Ekstrak etanol sampel dibuat dalam berbagai konsentrasi ( 10, 50, 100,

200 dan 250 ppm). Masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ke dalam

tiap tabung reaksi ditambahkan 500 l larutan DPPH 1mM dalam metanol.

Volume dihimpitkan sampai 5,0 ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama

30 menit, selanjutnya serapannya diukur pada panjang gelombang 515 nm.

29

Sebagai kontrol positif digunakan BHT dengan konsenterasi disesuaikan. Nilai

IC50 dihitung masing-masing dengan menggunakan rumus persamaan regresi.

[ Absorbansi kontrol Absrobansi sampel ] % inhibisi = x 100 % [ Absrobansi kontrol ] 2. Metode asam tiobutirat (TBA)

Ekstrak etanol sampel dibuat dalam konsenterasi 50, 100, 200 dan 500

ppm. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 mL lalu dilarutkan dalam 2 mL

buffer fosfat 0,1 M pH 7,0 dan 2 mL asam linolenat 50 mM dalam etanol 98,8%.

Larutan kontrol positif (kontrol antioksidan) digunakan 1 mL -tokoferol, 2 mL

buffer fosfat 0,1 M pH 7,0 dan 2 mL asam linolenat 50 mM dalam etanol 99,8%.

Larutan kontrol negatif terdiri atas 1 mL air bebas ion, 2 mL buffer fosfat 0,1 M

pH 7,0 dan 2 mL asam linolenat 50 mM dalam etanol 98.8%. Semua campuran

diletakkan dalam botol gelap berulir berpenutup dan diinkubasi pada suhu 400C.

Satu hari setelah waktu inkubasi maksimum dari metode Ferric

Thiocyanate (FTC) dilakukan pengukuran Thiobarbituric Acid Reactive

Substances (TBARS) melalui metode TBA (Kikuzaki & Nakatani, 1993) dengan

mengambil sebanyak 1 mL setiap larutan uji. Kemudian ditambahkan 2 mL

larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran

reaksi dikocok dan diletakkan pada penanggas air 1000C selama 10 menit. Setelah

dingin larutan disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit.

Kemudian absorbansinya diukur pada panjang gelombang 532 nm dengan 3 kali

ulangan.

Pembuatan kurva standar menggunakan larutan 1,1,3,3-

tetrametoksipropana (TMP) dengan konsenterasi 0.15, 0.30, 0.60, 0.75. 1.50, dan

3.0 M. Tiap larutan dari berbagai konsenterasi tersebut masing-masing dipipet 1

mL dan ditambah 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam

pelarut asam asetat 50%. Campuran reaksi dikocok dan diletakkan pada

penanggas air 1000 C selama 10 menit. Setelah dingin, larutan disentrufuse

dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Kemudian absrobansinya diukur

pada panjang gelombang 532 nm dengan dua kali ulangan.

30

Uji aktivitas antikanker

Uji aktivitas antikanker in vitro pada sel murine leukimia P388

menggunakan metode yang dikembangkan oleh Tokyo University of Pharmacy &

Life Science Hachioji Japan dan ITB. Sel P388 dibiakkan dalam media RPMI

1640 (lampiran 10) dilengkapi dengan 5% FBS (Fetal Bovin Serum) dan

kanamisin (100 g/ml). Sel (3 x 103 sel per sumur) di kultur dalam mikroplate

berisi 100 L media pertumbuhan per sumur dan diinkubasikan pada suhu 370C

selama 24 jam dalam kelembaban air 95% dan atmosfir 5% CO2. Kultur sel yang

digunakan untuk uji aktivitas antikanker memiliki viabilitas 95%.

Ekstrak uji sebanyak 10L dengan berbagai konsenterasi ditambahkan ke

dalam kultur sel sehari setelah transplantasi. Pada hari ketiga ditambahkan 20 L

larutan pewarna 3-(4,5-dimetil thiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida)

sebanyak 5 mg/ml per sumur. Setelah 4 jam inkubasi ditambahkan 100 L larutan

10% SDS-0,01N HCl ke dalam tiap sumur. Selanjutnya ditambahkan kristal

formazan dalam tiap sumur, larutkan dengan pengadukan menggunakan

mikropipet.

Pengukuran optikal densiti dilakukan menggunakan microplate reader

pada dua daerah panjang gelombang (550 dan 700 nm). Semua tahapan dilakukan

triplo.

Analisis Data

Data hasil penelitian dianalisis :

1. Toksisitas ekstrak metode BSLT. Nilai LC50 adalah konsenterasi (ppm) yang

diperlukan untuk membunuh 50% larva udang Artemia salina Leach. Nilai

LC50 ditentukan dengan Analisis Probit menggunakan Minitib 14.

2. Aktivitas antioksidan. Nilai IC50 adalah konsenterasi ekstrak yang diperlukan

melakukan peredaman (scavenging) radikal bebas terhadap radikal DPPH

sebesar 50%. Data dianalisis dengan persamaan regresi linear. Persen daya

hambat oksidasi asam linoleat didapat dari rata-rata MDA linoleat yang

terbentuk dibagi dengan rata-rata MDA tiap perlakuan yang terbentuk

dikalikan 100%.

31

3. Aktivitas antikanker. Nilai IC50 adalah konsenterasi ekstrak yang diperlukan

untuk penghambatan pertumbuhan sel kanker murine leukimia P388 sebesar

50 %. Data dianalisis dengan persamaan regresi linear.

32

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi

Ekstraksi bahan tumbuhan adalah tahap yang sangat penting dalam

memperoleh metabolit sekunder tumbuhan untuk dimanfaatkan sebagai obat.

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu merendam simplisia tumbuhan

pada suhu kamar selama 24 jam. Faktor yang paling penting mempengaruhi hasil

ekstraksi yaitu pelarut, waktu dan suhu dalam melakukan ekstraksi (Yang et al.

2007). Terdapat banyak metode dalam mengeksrak bahan tumbuhan diantaranya

adalah metode perkolasi, sokletasi dan destilasi uap. Metode perkolasi hanya baik

digunakan pada senyawa organik yang mudah larut sedangkan sokletasi dan

destilasi uap hanya baik pada senyawa yang tahan panas (Faraouq, 2003; Lenny,

2006). Oleh karena itu metode maserasi dipilih agar isolasi senyawa metabolit

sekunder dari ekstrak kulit batang langsat maksimal.

Tabel 3 Rendemen ekstrak Kulit Batang Langsat Basah (KBLB) dan Kulit

Batang Langat Kering (KBLK)

Simplisia Pelarut % Rendemen

KBLK Etanol 70% 5,92

Kloroform:Air 4,36

KBLB Etanol 70% 3,67

Kloroform:Air 2,16

Dari hasil ekstraksi diperoleh ekstrak etanol berwarna cokelat kehitaman

dan ekstrak kloform:air (1:1) bewarna hijau muda. Semua ekstrak beraroma khas

kulit langsat. Rendemen adalah persentasi antara ekstrak yang diperoleh terhadap

jumlah simplisia yang diekstraksi (Depkes, 1987). KBLK dimaserasi dengan

etanol 70% (1:5) selama 24 jam menghasilkan rendemen 5,92%. Residu KBLK

EtOH dimaserasi lagi dengan pelarut kloroform:air menghasilkan rendemen

4,36%. Dengan cara yang sama dilakukan pada KBLB EtOH. KBLB EtOH

menghasilkan rendemen sebesar 3,67%. Residu KBLB dimaserasi dengan

kloroform:air menghasilkan rendemen sebesar 2,16 % (tabel 3). Trusheva et al.

(2007) melakukan ekstraksi pada propolis menggunakan pelarut etanol dengan

membandingkan beberapa metode ekstraksi yaitu maserasi, UE (Ultrasound

33

Extraction) dan MAE (Microwave Assisted Extraction) ternyata metode maserasi

menghasilkan persen rendemen total 55,58% lebih besar dibandingkan metode UE

dan MAE dengan masing-masing rendemen yang diperoleh 41% dan 53%. Hal ini

menguatkan bahwa ekstraksi dengan pelarut etanol menggunakan metode

maserasi menghasilkan persen rendemen yang lebih besar dibandingkan dengan

metode ekstraksi lain. Oleh karena ekstrak etanol KBLK dan KBLB yang

memiliki persen rendemen tertinggi maka kedua ekstrak tersebut dilanjutkan

dalam bioassay aktivitas antioksidasi dan antikanker.

Menurut Faraouq (2003) ekstraksi simplisia tumbuhan untuk tujuan obat

herbal terbaik digunakan pelarut etanol. Etanol dapat bercampur dengan air dalam

berbagai perbandingan dan mudah dalam penguapan residu yang ada dalam

ekstrak. Pelarut metanol, etilasetat atau heksana tidak diperbolehkan karena residu

toksik yang dihasilkan. Selanjutnya ampas ekstrak etanol 70% dilanjutkan

dengan ekstraksi dan maserasi dengan kloroform:air yang bersifat semi polar.

Diharapkan metabolit sekunder yang belum tertarik oleh pelarut etanol dapat

ditarik oleh pelarut ini. Secara empiris kulit batang langsat basah yang digunakan

masyarakat Dimembe Kecamatan Minahasa Utara sebagai bahan obat direbus

dengan air dan diambil sarinya.

Analisis Fitokimia

Analisis fitokimia adalah satu cara mengetahui kandungan metabolit

sekunder pada suatu sampel tumbuhan. Dalam penelitian ini analisis fitokimia

menggunakan prosedur Harborne (1996). Senyawa-senyawa yang dianalisis

meliputi alkaloid, saponin, flavonoid, tanin, steroid dan triterpenoid.

Tabel 4 Hasil Analisis Fitokimia Kulit batang langsat basah (KBLB) dan Kulit Langat Batang Kering (KBLK) Golongan Senyawa

Hasil uji KBLK EtOH KBLK ka KBLB EtOH KBLB ka

Alkaloid + + + - Flavonoid + - + ++ Saponin + - ++ +++ Tanin + - + + Triterpenoid + - - - Steroid - - - - Keterangan : tanda ( + ) menunjukkan tingkat intensitas warna. EtOH (etanol) dan ka (kloform : air).

34

Ekstrak KBLK EtOH mengandung hampir seluruh golongan senyawa

fitokimia yang diidentifikasi kecuali steroid. Pada KBLB tidak mengandung

golongan senyawa triterpenoid dan steroid akan tetapi memiliki kandungan

saponin dengan intensitas yang lebih tinggi. KBLK kloroform:air hanya

teridentifikasi mengandung alkaloid berbeda dengan KBLB yang justru tidak

mengandung golongan senyawa alkaloid tetapi mengandung senyawa fenolik

yaitu flavonoid, saponin dan tanin dengan intensitas yang tinggi. Hal ini

disebabkan KBLB ketika diekstraksi dengan etanol masih memiliki kadar air yang

tinggi, pada saat ampasnya diekstraksi dengan kloform:air yang bersifat semi

polar golongan senyawa yang belum tertarik pada pelarut etanol tertarik dengan

baik pada pelarut kloroform:air. Triterpenoid dan steroid hanya terbentuk sedikit

endapan ketika diberikan pareaksi Wagner. Triterpenoid dan steroid adalah

metabolit sekunder derivat lipid yang bersifat nonpolar sehingga membutuhkan

pelarut nonpolar untuk dapat mengekstraksinya dengan baik.

Ekstraksi kulit batang langsat baik kering (kadar air 10%) maupun basah

dengan etanol menarik hampir semua golongan metabolit sekunder yaitu alkaloid,

flavonoid, tanin, saponin dan triterpenoid. Hal ini dikarenakan etanol adalah

pelarut yang memiliki dua gugus yang berbeda kepolarannya yaitu gugus

hidroksil yang bersifat polar dan gugus alkil yang bersifat nonpolar. Adanya

gugus ini sehingga senyawa-senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda akan

terekstrak dalam etanol. Dari hasil analisis fitokimia ini maka KBLK EtOH dan

KBLB EtOH yang dilanjutkan dengan uji bioassay antikanker dan antioksidasi.

Aktivitas Toksisitas Metode BSLT

BSLT adalah metode skrining farmakologi awal yang relatif murah dan

telah teruji hasilnya dengan tingkat kepercayaan 95%. Penggunaan larva udang

(A. salina Leach.) dalam bioassay toksisitas ekstrak kasar tanaman memenuhi

validitas karena individu yang digunakan memenuhi syarat untuk analisis statistik.

BSLT telah digunakan sebagai bioassay pendahuluan dalam rangka menilai

toksisitas ekstrak fungi, tumbuhan, logam berat, substansi toksin dari

sianobakteria dan pestisida (Carballo et al. (2002). Sekitar 300 bioaktif antitumor

35

baru dari tumbuhan awalnya diskrining dengan metode BSLT (Mc Laughlin et al.

1998).

Tabel 5 Nilai LC50 Ekstrak Etanol KBLK dan KBLB Simplisia LC50 (ppm) KBLK 93,48 KBLB 100,37

Larva udang memiliki kulit yang tipis dan peka terhadap lingkungannya.

Zat atau senyawa asing yang ada di lingkungannya akan terserap ke dalam tubuh

dengan cara difusi dan langsung mempengaruhi kehidupan larva. Larva udang

yang sensitif ini akan mati apabila zat atau senyawa asing dalam larutan bersifat

toksik.

Gambar 8 Histogram mortalitas A. salina Leach pada berbagai konsenterasi ekstrak

KBLK EtOH dan KBLB EtOH masing-masing memiliki LC50 93.48 ppm

dan 100.37 ppm (tabel 5 ). Beberapa penelitian tentang uji toksisitas awal dengan

BSLT dalam rangka penemuan obat antikanker antara lain ekstrak metanol dan

ekstrak eter Marchantia cf. planiloba Steph. memiliki nilai LC50 masing-masing 247.10 ppm dan 453,16 ppm (Sukardiman, 2004). Ekstrak metanol Fagonia

cretica L. menunjukkan nilai LC50 118.89 ppm pada uji BSLT (Hussain, 2006).

Mc Laughlin et al. (1998) menyatakan adanya korelasi positif antara LC50 uji

BSLT dengan uji sitotoksik 9KB (karsinoma nasofaring manusia). Harga ED50

36

9KB sama dengan sepersepuluh LC50 BSLT. Suatu ekstrak bahan alam berpotensi

antikanker dengan uji BSLT apabila nilai LC50 < 1000 ppm (Carballo et al. 2002).

Dibandingkan dengan beberapa hasil penelitian tersebut ekstrak etanol kulit

batang langsat (L. domesticum L.) memiliki toksisitas (LC50)