3

2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Ikan Bandeng

Ikan bandeng merupakan salah satu ikan laut yang memiliki potensi untuk

dibudidayakan di tambak. Jenis ikan ini mampu mentolerir salinitas perairan yang

luas (0-158 ppt) sehingga digolongkan sebagai ikan euryhaline. Ikan bandeng

mampu beradaptasi terhadap perubahan lingkungan, seperti suhu, pH, dan

kekeruhan air serta tahan terhadap serangan penyakit (Ghufron dan Kardi 1997).

Ikan ini memiliki karakteristik badan langsing, sisik seperti kaca, serta

daging berwarna putih. Ikan bandeng mendapat julukan ikan milkfish karena

mempunyai daging berwarna putih, seperti susu dan rasanya pulen. Ikan ini

memiliki keunikan mulutnya tidak bergigi dan makanannya tumbuh-tumbuhan di

dasar laut. Selain itu, panjang usus ikan bandeng sembilan kali dari panjang

tubuhnya (Murtidjo 1989). Klasifikasi ikan bandeng menurut Saanin (1984)

adalah sebagai berikut :

Phylum : Chordata

Sub phylum : Vertebrata

Kelas : Pisces

Sub kelas :Teleostei

Ordo : Malacopterigii

Famili : Chanidae

Genus :Chanos

Spesies :Chanos chanos

Ikan bandeng mempunyai ciri-ciri morfologi dengan bentuk tubuh ramping,

badannya tertutup oleh sisik, jari-jari semuanya lunak dan jumlah sirip punggung

antara 14-16, pada sirip dubur antara 10-11, pada sirip dada antara 16-17 dan pada

sirip perut antara 11-12. Sirip ekor panjang dan bercagak. Mata diselimuti lendir

dan tidak ada skut pada bagian perut (Djuhanda 1981). Morfologi ikan bandeng

dapat dilihat pada Gambar 1.

4

Gambar 1 Ikan bandeng (Chanos chanos) (Anonim 2010).

Jumlah sisik pada gurat sisi ada 75-80 keping. Mulutnya berukuran sedang dan

nono protractile, yaitu posisi mulut satu garis dengan sisi bawah bola mata,

bentuk tubuhnya, seperti panah (Djuhanda 1981).

2.2 Kemunduran Mutu Ikan Bandeng

Setelah ikan mati, ikan segera mengalami proses kemunduran mutu.

Kemunduran mutu pada ikan bisa disebabkan karena proses yang terjadi pada

tubuh ikan atau karena lingkungan. Proses kemunduran mutu ikan terjadi karena

aktivitas enzim, mikroorganisme, dan kimiawi (Ilyas 1993). Ketiga hal tersebut

menyebabkan tingkat kesegaran ikan menurun. Proses perubahan ikan setelah

mati terdiri dari empat tahap, yaitu prerigor, rigor mortis, post rigor, dan busuk.

2.2.1 Fase prerigor

Fase prerigor merupakan tahap pertama dari postmortem. Tahap ini ditandai

dengan peristiwa terlepasnya lendir dari kelenjar di bawah permukaan kulit.

Lendir yang dikeluarkan ini sebagian besar terdiri dari glukoprotein dan musin

yang merupakan media yang cocok bagi pertumbuhan bakteri (Junianto 2003).

Peristiwa ini terjadi ketika jaringan otot yang mulai lembut dan lentur yang

disebabkan karena proses biokimia, yaitu penurunan tingkat ATP dan keratin

fosfat serta adanya proses glikolisis aktif. Glikolisis merupakan suatu proses

konversi glikogen menjadi asam laktat yang menyebabkan pH turun. Tingkat

perubahan pH bervariasi antara satu spesies dengan spesies yang lain seperti juga

diantara otot yang berbeda. Namun, hewan dalam keadaan kenyang dan

istirahat mempunyai cadangan glikogen yang besar, sehingga dalam keadaan post

mortem daging yang dihasilkan memiliki pH lebih rendah dibandingkan

dengan daging hewan yang dihasilkan dalam keadaan lapar atau stres pada saat

disembelih (Eskin 1990).

5

2.2.2 Fase rigormortis

Fase rigormortis merupakan akibat dari suatu rangkaian perubahan kimia

yang kompleks di dalam otot ikan sesudah kematiannya. Setelah ikan mati,

sirkulasi darah terhenti dan suplai oksigen berkurang sehingga terjadi perubahan

glikogen menjadi asam laktat. Perubahan ini menyebabkan pH tubuh ikan

menurun, diikuti dengan penurunan jumlah ATP dan ketidakmampuan

mempertahankan kekenyalan oleh jaringan otot. Tinggi rendahnya pH awal ikan

sangat tergantung pada jumlah glikogen yang ada dan kekuatan penyangga pada

daging ikan. Pada fase ini, pH tubuh ikan menjadi 6,2-6,6 dari pH semula 6,9-7,2

(Junianto 2003). Hal ini menstimulasi enzim-enzim yang menghidrolisis fosfat

organik. Fosfat yang pertama kali terurai adalah fosfat keratin dengan membentuk

keratin dan asam fosfat, kemudian diikuti oleh terurainya adenosin trifosfat (ATP)

membentuk adenosin difosfat (ADP) dan asam fosfat (Irianto dan Giyatmi 2009).

Pada fase ini belum terjadi aktivitas bakteri yang berarti, pH ikan masih turun

dikarenakan penumpukan asam laktat sehingga bakteri belum bisa tumbuh dengan

baik (Adawyah 2007).

Fase rigormortis ini biasanya berlangsung sekitar 5 jam. Selama berada

dalam tahap rigormortis ini, ikan masih dalam keadaan sangat segar. Ini berarti

bahwa apabila rigormortis dapat dipertahankan lebih lama maka proses

pembusukan dapat ditekan (Irianto dan Giyatmi 2009).

2.2.3 Fase postrigor

Fase postrigor ditandai dengan melunaknya daging. Proses ini diawali

terjadinya proses autolisis. Proses autolisis tidak dapat dihentikan walaupun pada

suhu yang rendah. Nilai pH yang semakin turun menyebabkan enzim-enzim

dalam jaringan otot menjadi aktif. Katepsin, yaitu enzim proteolitik yang

berfungsi menguraikan protein menjadi senyawa sederhana, merombak struktur

jaringan protein otot menjadi lebih longgar sehingga rentan terhadap serangan

bakteri. Demikian pula enzim lain yang ada dalam organ tubuh ikan, misalnya

perut, melakukan aktivitas yang sama. Hal ini mengakibatkan daging ikan

menjadi agak lunak. Fase perombakan jaringan oleh enzim dalam tubuh ikan ini

disebut dengan autolisis. Ikan dalam fase autolisis ini sering masih dianggap

6

cukup segar dan layak dimakan. Meskipun demikian, fase ini merupakan fase

transisi antara segar dan busuk (Irianto dan Giyatmi 2009).

Penguraian protein menghasilkan senyawa amonia yang terjadi pada fase

ini. Hal ini akan berpengaruh terhadap kondisi pH yang semakin naik dengan

semakin banyaknya senyawa volatil yang dihasilkan. Biasanya proses autolisis

akan selalu diikuti dengan meningkatnya jumlah bakteri (Junianto 2003).

2.2.4 Fase busuk

Fase busuk merupakan fase akhir dari kemunduran mutu pada ikan dan ikan

sudah tidak dapat dikonsumsi. Mikroorganisme dominan yang berperan penting di

dalam proses penurunan kesegaran ikan adalah bakteri. Dekomposisi berjalan

intensif, khususnya setelah ikan melewati fase rigormortis, pada saat jaringan otot

longgar dan jarak antar serta diisi oleh cairan. Bakteri mengeluarkan getah

pencernaan, enzim yang merusak dan menghancurkan jaringan. Bakteri pada

daging menyebabkan perubahan bau dan rasa, perubahan tampilan dan ciri fisik

lendir, serta warna kulit ikan hilang dan menjadi tampak pucat dan pudar. Lapisan

perut menjadi pucat dan hampir lepas dari dinding bagian dalam tubuh (Irianto

dan Giyatmi 2009).

2.3 Anatomi Usus

Usus ikan bandeng panjang dan sempit dengan banyak pyloric caeca di

daerah anterior dan mempunyai mukosa yang berfungsi untuk pencernaan dan

penyerapan dengan konsentrasi yang tinggi (Lee et al. 1986). Usus ikan bandeng

tidak bisa dibedakan antara duodenum dan ileum. Bagian tersebut berhubungan

dengan caeca usus yang berjumlah kurang lebih 120 hingga 150 unit. Caeca usus

berbentuk sederhana dan bercabang, seperti organ jari dengan panjang berbeda-

beda. Bentuknya kompak dan terletak antara pyloric stomach dan lekukan usus

(George dan Chandy 1959). Panjang usus bergantung pada jenis makanannya,

usus ikan berupa tabung sederhana yang berukuran sama dari lambung sampai

dubur. Bentuknya dapat lurus seperti pada ikan betutu dan lele atau melingkar-

lingkar seperti ikan nila, mas, dan gurame bergantung pada bentuk rongga perut.

Usus mempunyai lapisan epitel kolumnar sederhana, sel lendir melapisi lapisan

submukosa yang berisi sel eosinofilik bergranula, berbatasan dengan mukosa

muskularis lapisan usus (Kusrini 2007).

7

Bagian lumen pada usus dikelilingi oleh empat lapisan, yaitu serosa,

muskularis, submukosa, dan mukosa. Serosa adalah membran yang lembut yang

menyelimuti lapisan muskularis. Muskularis terdiri dari longitudinal luar dan

lapisan sirkular dalam. Submukosa merupakan lapisan tipis yang bercabang ke

dalam mukosa. Sel darah, tipe leukosit berserak atau banyak terdapat dalam

submukosa. Mukosa merupakan lapisan yang terlihat, seperti epitelium berbentuk

kubus yang ciri-cirinya sederhana atau bercabang dengan vili panjang. Sel epitel

sempit dan panjang dengan dasar nukleus dan tersusun kompak. Sel mukosa luas

dengan berbagai tahap aktivitas yang seluruhnya terjadi pada lekukan usus.

Caeca usus merupakan perpanjangan pada usus. Kelenjar mukosa banyak terdapat

pada caeca (George dan Chandy 1959).

Gambar 2 Dinding usus dengan perbesaran 17x secara skematis dalam tiga

dimensi (Genesser 1994).

2.4 Anatomi Ginjal

Organ ginjal pada ikan berfungsi sebagai alat ekskresi dan osmoregulasi.

Ginjal mempunyai peranan penting dalam ekskresi sisa nitrogen dan mengatur

keseimbangan kadar air dan garam (homeostasis) (Piska dan Naik 1992).

8

Gambar 3 Susunan histologik suatu korpuskel ginjal secara skematis dalam tiga

dimensi (Genesser 1994).

Ginjal terdiri dari sejumlah besar tubulus nefron yang berkembang dari

depan ke belakang. Struktur ginjal memanjang, berpasangan, dan terletak di atas

saluran pencernaan dan dekat dengan tulang punggung. Ginjal ikan teleostei

umumnya dibagi menjadi dua bagian, yaitu kepala dan batang ginjal. Batang

ginjal terdiri dari sejumlah besar nefron, masing-masing terdiri dari sel darah

ginjal atau badan Malphigi dan tubulus. Ruang intertubular penuh dari jaringan

limfoid yang terdistribusikan tidak merata. Ginjal bagian kepala umumnya terdiri

dari limfoid, hematopoietik, interrenal dan jaringan chromaffin (supra renal), serta

tubulus. Bermacam-macam variasi dalam jumlah, bentuk, dan ukuran sel-sel

ginjal. Sel-sel ginjal besar jarang ditemukan. Ginjal ikan laut sebagian besar

memiliki glomerulus dan sel ginjal yang kurang berkembang dengan baik, dan

mungkin non-fungsional (Piska dan Naik 1992).

2.5 Anatomi Hati

Hati merupakan organ dalam terbesar dari tubuh. Selain itu, hati juga

merupakan jaringan terbesar kelenjar. Di dalam organ hati, nutrisi akan

diserap oleh saluran pencernaan, diproses, dan kemudian disimpan untuk

digunakan oleh bagian tubuh yang lain. Metabolisme memiliki berbagai fungsi

9

(misalnya sintesis protein, penyimpanan metabolit, sekresi empedu, detoksifikasi,

dan inaktivasi) yang mempunyai peranan penting dalam mempertahankan hidup.

Hati akan menerima darah melalui vena portal atau arteri hepatik. Sebagian dari

darah (70-80%) berasal dari vena portal yang membawa darah mengandung

nutrisi dan akan diserap di dalam usus. Arteri hati merupakan sebuah cabang dari

sumbu celiac yang beroksigen di dalam hati (Akiyoshi dan Inoue 2004).

Hati terletak di sisi rongga tubuh dorsal, berdekatan dengan tulang

punggung, dengan beberapa meluas ke dasar sirip dada dekat ginjal anterior. Hati

dikelilingi oleh kapsula jaringan ikat yang tipis, yaitu kapsula glisson, yang

ditutupi oleh serosa hampir pada seluruh permukaannya. Di dalam kapsula glisson

terdapat beberapa pembuluh darah kecil. Jaringan ikat membagi parenkim hati

menjadi lobus, unit struktural yang disebut jaringan ikat portal atau jaringan ikat

interlobular. Jaringan ikat mengelilingi portal triad, yaitu gabungan tiga saluran

berisi cabang arteri hepatika, vena porta, dan duktus biliaris (Genesser 1994).

Gambar 4 Histologi hati dengan pewarnaan HE perbesaran 75x (Genesser 1994).

Lobulus hati

Jaringan ikat

portal

Vena sentralis

Portal triad

10

Gambar 5 Hati ikan normal, (*) hepatosit dengan sitoplasma granular, dan inti

pusat yang berbentuk bulat (panah) skala bar 10 mm, H.E. (Camargo

dan Martinez 2007).

Hati juga merupakan organ vital yang berfungsi sebagai detoksifikasi dan

mensekresikan bahan kimia yang digunakan untuk proses pencernaan. Hati

berperan penting dalam proses metabolisme dan transformasi bahan pencemar

dari lingkungan. Dengan demikian hati merupakan organ yang paling banyak

mengakumulasi zat toksik sehingga mudah terkena efek toksik. Sebagian zat

toksik yang masuk ke dalam tubuh setelah diserap oleh sel akan dibawa ke hati

oleh vena porta hati sehingga hati berpotensi mengalami kerusakan. Adanya zat

toksik akan mempengaruhi struktur histologi hati sehingga dapat mengakibatkan

patologis hati seperti pembengkakan sel, rangkaian nekrosis atau bridging

necrosis, degenarasi intralobular dan fokal nekrosis, fibrosis, serta cirrhosis

(Camargo dan Martinez 2007).

2.6 Histologi

Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu histos yang berarti jaringan dan

logos yang berarti ilmu. Jadi histologi berarti suatu ilmu yang menguraikan

struktur dari hewan secara terperinci dan hubungan antara struktur

pengorganisasian sel dan jaringan serta fungsi-fungsinya. Jaringan merupakan

sekumpulan sel yang tersimpan dalam suatu kerangka struktur atau matriks yang

mempunyai suatu kesatuan organisasi yang mampu mempertahankan keutuhan

dan penyesuaian terhadap lingkungan diluar batas dirinya (Bavelander 1998).

11

Sajian histologi merupakan suatu irisan jaringan yang sangat tipis, yang

cocok untuk dipelajari di bawah mikroskop cahaya atau mikroskop elektron.

Sajian ini berfungsi sebagai pengamatan sesaat terhadap apa yang terjadi pada saat

itu di dalam jaringan. Sajian yang akan diamati dengan mikroskop cahaya harus

cukup tipis agar cukup ditembus cahaya dan menghindarkan tumpang tindih

visual oleh berbagai unsurnya. Untuk mikroskopi cahaya biasanya sajian dibuat

dengan teknik parafin (Cormack 1992).

Mikroteknik adalah ilmu yang mempelajari tentang pembuatan preparat.

Setiap pembuatan preparat pada umumnya selalu dilakukan fiksasi terlebih

dahulu. Fiksasi itu sendiri adalah suatu cara atau proses (metode) yang bertujuan

untuk mematikan sel tanpa mengubah fungsi dan struktur di dalam sel itu sendiri.

Jika telah dilakukan fiksasi maka preparat yang dibuat akan menjadi lebih awet

dan tahan lama (Kiernan 1990).

2.7 Pemeriksaan Histologi

Histologi merupakan salah satu cabang ilmu yang mempelajari tentang

organ atau bagian tubuh hewan atau tumbuhan secara cermat dan rinci. Upaya

untuk mengamati, mempelajari serta meneliti jaringan-jaringan dari organisme

tertentu dapat dilakukan dengan cara pembuatan spesimen atau preparat histologi.

Menurut Davenport (1960) diacu dalam Gunarso (1986) penyiapan spesimen

histologi secara umum dilakukan dengan 4 cara, yaitu:

(1) penyiapan preparat/spesimen secara keseluruhan (whole mount), yaitu

pengamatan perkembangan embrio dan lain sebagainya;

(2) penyiapan spesimen dengan metode penyayatan (sectioning methods);

(3) penyiapan dengan metode remasan (teasing/squashing methods);

(4) penyiapan dengan menggunakan metode ulasan (smear methods).

Metode penyayatan (sectioning) adalah suatu metode yang banyak

digunakan dalam penyiapan spesimen histologi. Metode ini dilakukan dengan

menyayat spesimen hingga sangat tipis, kemudian diwarnai dan dijadikan

spesimen awetan. Penyayatan dilakukan menggunakan mikrotom. Spesimen

dilakukan perlakuan pengerasan agar memudahkan dalam penyayatan. Pengerasan

jaringan dilakukan dengan cara membekukan atau dengan penanaman dalam suatu

12

substansi yang mampu mengeraskannya (Davenport 1960 diacu dalam Gunarso

1986).

Pembuatan preparat dengan metode parafin merupakan suatu metode yang

paling umum digunakan. Metode ini banyak digunakan karena pembuatannya

lebih mudah dan lebih cepat serta material kering dapat disimpan lebih lama

(Kiernan 1990). Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik

tumbuhan ataupun hewan menggunakan parafin. Kelebihan metode ini ialah irisan

jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin. Tebal

irisan dengan metode beku rata-rata diatas 10 mikron, tetapi dengan

metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan

yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini.

Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut, dan

mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan dengan

menggunakan metode ini karena sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada

jaringan akan larut (Kiernan 1990).

Langkah-langkah dalam teknik histologi secara manual adalah fiksasi atau

pengawetan jaringan, perlakuan (processing) jaringan, pemotongan jaringan,

pewarnaan jaringan, serta pengamatan menggunakan mikroskop (Angka et al.

1990). Tahapan dalam persiapan preparat adalah fiksasi, dehidrasi, clearing,

impregnasi dan embedding, blocking dan trimming, pemotongan, pewarnaan, dan

perekatan jaringan.

Fiksasi merupakan tahap awal pembuatan preparat histologi yang dilakukan

untuk mencegah autolisis dan dekomposisi postmortem dari suatu jaringan atau

organ. Selain itu, fiksasi akan membuat padat suatu jaringan lunak. Hal ini

disebabkan karena bahan fiksatif akan mengkoagulasi protein dalam sel dan

jaringan. Fiksasi juga bertujuan untuk mengawetkan morfologi dan komposisi

jaringan sehingga jaringan tetap, seperti keadaan semula sewaktu hidup, serta

memudahkan pemulasan atau pewarnaan jaringan yang akan dilakukan pada

tahapan selanjutnya (Cormack 1992).

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan jaringan histologis

antara lain: tebal irisan jaringan 3-5 mm sehingga cairan fiksasi dapat dengan

cepat memfiksasi seluruh jaringan, volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya

13

harus 15-20x volume jaringan yang akan difiksasi. Besarnya volume jaringan

menentukan volume fiksasi yang diperlukan sedangkan tebal jaringan menentukan

kecepatan fiksasi. Panjang dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis

mikrotom yang akan digunakan, dan jenis cairan fiksasi yang akan digunakan

bergantung kepada unsur jaringan yang akan didemonstrasikan dan kepada jenis

pewarnaan yang akan digunakan. Untuk keperluan praktis, cairan fiksasi dapat

dibedakan menjadi 3 kelompok, yaitu micro-anatomical fixation, cytological

fixatives, dan histochemical fixatives (Kiernan 1990).

Larutan fiksasi disebut fiksatif. Beberapa fiksatif yang dapat digunakan

antara lain fiksatif Zenker, fiksatif Clarke’s, fiksatif Carnoys, Buffer Normal

Formalin (BNF), fiksatif Alcohol-formalin-acetic mixtures, larutan Bouin’s,

Larutan Helly’s, fiksatif Altmann’s, larutan Gendre’s dan fiksatif Heidenhain ‘s

(Kiernan 1990). Formula fiksatif BNF adalah (Kiernan 1990):

Sodium phosphate

NaH2PO4.H2O : 4,0 g

Na2HPO4 (anhidrid) : 6,5 g

Akuades : 900 ml

Formaldehid 37-40 % : 100 ml

Waktu minimum yang dibutuhkan untuk jaringan dalam fiksatif ini adalah

24 jam dan maksimum 1 minggu. Konsentrasi formaldehid tidak terlalu

berpengaruh, dan berkisar dari 2,5-10%. Fiksasi dilakukan dengan cara

membenamkan potongan kecil jaringan ke dalam larutan fiksatif. Pengambilan

jaringan dilakukan dengan pisau yang tajam. Hal ini bertujuan untuk menghindari

kerusakan pada jaringan (Genesser 1994).

14

Tabel 1 Kelebihan dan kekurangan berbagai larutan pengawet

Larutan

Pengawet Kelebihan Kekurangan

Formalin Cairan pengawet umum, pH netral,

potongan jaringan dapat ditinggalkan

dalam pengawet tanpa terjadi

perubahan berarti (sampai 1 tahun)

Waktu perendaman > 24 jam,

terjadi pengerutan jaringan

Muller Daya penetrasi cepat dan baik,

memfiksasi nukleus dan sitoplasma

dengan baik

Jika sampel direndam dalam

pengawet (> 24 jam), jaringan

menjadi rapuh, tidak dapat

dipakai untuk pewarnaan dengan

metode histokimia, harus dicuci

dulu dengan air kran mengalir

sebelum dilakukan dehidrasi

Bouin Daya penetrasi cepat dan merata tetapi

menyebabkan pengerutan, memberikan

warna cemerlang bila diwarnai dengan

metode trichrome, sangat baik untuk

nukleus dan kromoson, warna kuning

membuat jaringan mudah dilihat saat

perendaman dan pengirisan jaringan

Bila direndam dalam pengawet

(> 24 jam), jaringan menjadi

rapuh, harus dicuci dulu dengan

air kran untuk menghilangkan

kelebihan pikrat

Zenker

Formol

(Cairan

Helly)

Daya fiksasi cepat dan kuat, sangat

baik untuk fiksasi sumsum tulang,

limpa dan organ lain yang banyak

mengandung darah, warna sitoplasma

menjadi lebih cemerlang

Pemaparan jaringan dalam

larutan yang melebihi waktu

yang ditentukan mengakibatkan

jaringan rapuh

Sumber: Kiernan 1990

Proses dehidrasi dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan air atau

menarik cairan yang ada dalam jaringan setelah proses fiksasi dan digantikan

parafin. Kandungan air yang tinggi akan menghambat proses selanjutnya. Cairan

dalam jaringan akan menyebabkan jaringan menjadi lunak, berisi lumen dan

mudah rusak saat penyayatan (Sass 1951).

Clearing merupakan suatu proses penjernihan yang bertujuan untuk

menggantikan alkohol. Proses clearing dilakukan dengan menambahkan clearing

agent yang berfungsi untuk melarutkan parafin. Pada proses ini jaringan menjadi

jernih dan transparan sehingga tidak tertembus cahaya. Bahan yang dapat

digunakan sebagai clearing agent, yaitu xylol, kloroform, dan benzol. Xylol

banyak digunakan karena bekerja dengan cepat, membuat preparat cukup

transparan dan bersifat dealkoholisasi (Sastrohadinoto et al. 1973). Menurut

15

Angka et al (1990), Setelah dilakukan proses dehidrasi, air di dalam sel akan

keluar. Bagian yang kosong akan terisi parafin agar jaringan terikat kuat dengan

parafin. Alkohol tidak dapat melarutkan parafin, oleh sebab itu digunakan xylol

yang dapat melarutkan parafin dan dapat bercampur dengan alkohol.

Impregnasi merupakan proses pemasukan medium tanam ke dalam jaringan

secara bertahap. Medium yang digunakan untuk menanam adalah parafin.

Embedding adalah proses untuk memasukkan parafin cair ke dalam jaringan.

Proses ini berlangsung di dalam oven pada suhu 60 oC karena titik cair parafin

pada suhu 54 oC-58

oC. Proses ini bertujuan agar parafin menyusup ke dalam

seluruh celah antar sel dan bahkan ke dalam sel sehingga jaringan lebih tahan saat

dilakukan pemotongan (Angka et al. 1990). Pada suhu yang lebih tinggi dari titik

cair parafin sisa-sisa dehidratant dan clearing agent akan lebih cepat menguap

(Sastrohadinoto et al. 1973). Proses pembenaman ke dalam parafin membantu

memudahkan pemotongan jaringan yang sangat tipis.

Jaringan yang telah dilakukan proses embedding menggunakan parafin cair

lalu diblok (dicetak agar mudah dipotong) dengan parafin cair yang kemudian

dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang

kaku seperti kertas kalender dengan ukuran 2x2x2 cm3. Parafin cair dituangkan ke

dalam cetakan hingga memenuhi sekitar 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan hingga

sedikit membeku. Setelah itu, jaringan disusun dalam cetakan dan dituangi parafin

cair hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan beku dalam suhu

ruang selama 24 jam (Angka et al. 1990).

Blok parafin dikeluarkan dari cetakan setelah mengeras dan ditriming

menggunakan silet. Tujuan dilakukannya trimming yakni membuang parafin yang

berlebihan, mengatur bentuk potongannya agar rapi dan agar dapat disesuaikan

dengan tempat blok alat pemotong (Sastrohadinoto et al. 1973, Angka et al.

1990).

Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan pisau khusus yaitu

mikrotom. Alat ini dilengkapi dengan pisau yang sangat tajam dan ketebalan

irisan yang diingikan. Menurut Kiernan (1990) mikrotom ada beberapa macam

yaitu :

16

(1) Mikrotom geser (sliding mikrotome).

Pada alat ini, jaringan tetap berada pada tempatnya, sedang pisaunya yang

bergerak. Pada umumnya jaringan yang akan dipotong dengan mikrotom geser

adalah jaringan yang tanpa penanaman (embedding ) terlebih dulu. Jaringan yang

akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan pewarnaan tunggal, ataupun tanpa

warna terlebih dahulu. Metode ini banyak dikerjakan untuk pengirisan jaringan

tumbuh-tumbuhan.

(2) Mikrotom beku ( freezing microtome).

Alat ini dihubungkan dengan tabung berisi CO2 dingin, melalui suatu pipa

karet. Mikrotom ini keadaannya sama dengan mikrotom geser yaitu jaringan tetap

berada pada tempatnya sedangkan pisau mikrotomnya yang bergerak ke muka dan

ke belakang. Fiksasi dapat dijalankan setelah pemotongan dan sebelum

pewarnaan.

(3) Mikrotom putar (rotary microtome).

Mikrotom ini letak pisau tetap pada tempatnya, sedangkan jaringannya yang

bergerak ke atas dan ke bawah. Hal inilah yang membedakan mikrotom ini

dengan kedua jenis mikrotom di atas. Jenis mikrotom ini yang biasanya digunakan

untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin.

Sayatan untuk jaringan keras dengan ketebalan 7-8 µm, sedangkan untuk

jaringan lunak seperti daging, hati, ginjal dan lain-lain ketebalannya 5-6 µm. Pita

parafin diletakkan di permukaan air hangat/waterbath (45 oC-50

oC). Hal ini

bertujuan agar jaringan di dalam parafin teregang. Pita parafin diangkat dari

permukaan air dengan menggunakan slide yang sebelumnya telah direndam di

dalam metanol. Perendaman ini bertujuan untuk membersihkan kotoran yang

menempel pada slide. Preparat yang telah merekat pada slide dibiarkan hingga

mengering.

Pewarnaan dilakukan dengan melekatkan irisan jaringan pada kaca obyek.

Sebelum pewarnaan harus dilakukan penghilangan parafin yang ada di dalam

jaringan menggunakan xilene (xylol) kemudian dilakukan hidrasi dengan

konsentrasi alkohol yang menurun, yaitu alkohol 100%, 100%, 95%, 90%, 80%,

70%, dan 50% masing-masing selama 3 menit. Penghilangan parafin bertujuan

agar jaringan menjadi jernih (Angka et al. 1990).

17

Pewarnaan histologi pada umumnya menggunakan kombinasi hematoksilin

dan eosin (HE). Hematoksilin dan eosin adalah metode pewarnaan yang berfungsi

ganda. Pertama memungkinkan pengenalan komponen jaringan tertentu dengan

cara memulasnya secara differensial. Kedua, dapat memulas dengan tingkat atau

derajat warna berbeda yang menghasilkan kedalaman pulasan yang berbeda.

Hematoksilin berasal dari ekstrak dari pohon yang diberi nama logwood tree.

Pada pulasan H & E, kompleks warna hemaktosilin berwarna ungu tua. Pewarna

eosin memberikan warna merah muda sampai merah pada komponen jaringan

yang tidak terpulas ungu-biru oleh hemaktosilin. Hematoksilin bekerja sebagai

pewarna basa. Zat ini mewarnai unsur basofilik pada jaringan. Eosin bersifat asam

serta memulas komponen asidofilik pada jaringan (Cormack 1992).

Mounting adalah suatu proses perekatan sayatan jaringan pada kaca sediaan

menggunakan bahan perekat (adhesive). Proses mounting dilakukan menggunakan

mounting media. Mounting media merupakan zat pengisi antara preparat yang

telah diwarnai dengan kaca penutup. Terdapat dua jenis mounting media, yaitu

dalam bentuk resin dan cairan. Resin media terdiri dari tiga tipe, yaitu alami, semi

sintetis, dan sintetis sepenuhnya. Contoh resin media adalah Canada Balsam.

Canada balsam merupakan mounting alami yang terdiri dari komponen volatil,

yaitu resin yang merupakan cairan kental berwarna kuning dan meleleh ketika

dipanaskan. Balsam yang dikeringkan akan berbentuk padat dan harus

ditambahkan xylene sehingga dapat digunakan sebagai mounting media.

Komponen tak jenuh dalam resin membuat Canada balsam sebagai agen

pereduksi ringan. Oleh karena itu, media Canada balsam dapat mempertahankan

warna pada preparat awetan histologi lebih dari satu bulan atau satu tahun. Contoh

mounting media dalam bentuk cairan, antara lain Gliserol jelly, Buffer gliserol

dengan PDD, fructose syrup, dan Apathy’s medium (Cormack 1992).

Penutupan kaca obyek dilakukan dengan menutupkan kaca penutup di atas

sajian, sehingga apabila xylol dalam media penjernih menguap maka kaca

penutup melekat erat dengan kaca obyek. Hal ini dilakukan agar permukaan yang

dihasilkan tidak menyebabkan pantulan cahaya selama pengamatan mikroskopis

(Geneser 1994).