2-Tecnicas de Proteinas
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Aislamiento y Purificación de Proteínas
CélulasTejidos
Lisis Sonicación, DetergentesCriofractura, Embolo-aspas
Protección de Proteínas
Aislamiento y Purificación de Proteínas
Homogenizado
Centrifugación
Diferencial
Gradientes
Centrifugación Diferencial
Centrifugación Diferencial
Centrifugación en Gradientes
Zonas de Velocidad
Centrifugación en Gradientes
Zonas de Velocidad
Centrifugación en Gradientes
TÉCNICAS PARA LASEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
CROMATOGRAFÍAS
COLUMNASCROMATOGRÁFICAS
Fase estacionariaMatriz
Fase móvilSolución
Cromatografía Filtración en gel(Exclusión por tamaño)
Cromatografía Intercambio Iónico
Cromatografía de Afinidad
TÉCNICAS PARA LASEPARACIÓN Y DETECCIÓN
DE PROTEÍNAS
INMUNOFLORESCENCIAELISA
ELECTROFORÉSIS
Biotina - Avidina
Biotina - Avidina
Biotina – Avidina - Enzima
Concepto Básico de Absorción y Emisión
Estructuras de Fluoroforos
Estructuras de Fluoroforos
Espectro de Excitación y Emisión
Molecular Fluorescent Probes
• Específicos (e.g. DAPI)
• Unión a proteínas
• Anticuerpos
• Expresión en células vivas u organismos
Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia
There are Different Fluorescent Molecules for Different Jobs
See Molecular Probes Catalog; Sigma Catalog; CloneTech for GFP
Molecular probes
Detección con Ac - Conjugados
Detección con Ac - Conjugados
Detección con Ac - Conjugados
Detección con Ac - Conjugados
ENZIME – LINKED
IMMUNOABSORBANT ASSAYS
ELISA
ENZIME – LINKED
IMMUNOABSORBANT ASSAYS
ELISA
ENZIME – LINKED
IMMUNOABSORBANT ASSAYS
ELISA
Es una prueba rápida por la que un anticuerpoo antígeno se une a una enzima como mediopara detectar una relación entre el anticuerpoy el antígeno.
La reacción enzimática produce un cambio decolor relativo a la cantidad de proteínapresente.
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
ELISA
ELISA
= Antígeno
Unión del Ag
Detección
ELISA SANDUCHE
Detección de Ag
Ag
Unión del Ac
Detección
= Antígeno
ELISA - Indirecto
Detección deAb / Ac
PAGE
WESTERN BLOT
Marcaje y purificación proteínas
Por Biotina - estreptavidina
Purificación Biotina - Avidina
Ethynyl
Azida
Ethynyl
Azida
labeling by azidohomoalanine (AHA)