2. Respon Seluler Dan Ekspresi Cytokines Yang Berperan Dalam Kesembuhan Dari Infeksi Virus Penyakit...

77

Buletin Veteriner, BBVet Denpasar, Vol. XXIII, No.79, Desember 2011 ISSN: 0854-901X

RESPON SELULER DAN EKSPRESI CYTOKINES YANG BERPERAN DALAM KESEMBUHAN DARI INFEKSI VIRUS PENYAKIT JEMBRANA

PADA SAPI BALI 1

(The cellular responses and expression of cytokines that responsible for the recovery process in Jembrana disease virus-infected Bali cattle)

I Wayan Masa Tenaya

Balai Besar Veteriner Denpasar

ABSTRAK

Untuk mengetahui respon seluler dan ekspresi cytokines dalam proses penyembuhan dari infeksi virus penyakit Jembrana (JDV) pada sapi Bali, dilakukan studi menggunakan analisa flowcytometri dan real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Dengan analisa flowcytometri diketahui bahwa semua komponen limposit CD4+T-cells, CD8+T-cells dan CD21+B-cells menurun selama phase demam dan CD4+T-cells mengalami penurunan yang paling signifikan (p

78


condition coincided with a significant reduction of RNA JDV (p

79


Holland, 2005). TNF- terutama di produksi oleh macrophages, mast cells dan sel sel T, dengan fungsi utamanya mengatur sel sel imunitas, merangsang apoptosis kematian sel, aktivasi macrophages dan cytotoxic cells, menyebabkan reaksi radang, perkembangan tumor dan merangsang replikasi virus (Corral dkk., 1999; Locksley dkk., 2001). Sedangkan IL-2 di buat oleh sel sel T dengan peran utama membantu perkembangan sel sel T cytotoxic CD8+, CD4+ T sel sel B, meningkatkan daya bunuh macrophages dan mengatur perbanyakan sel sel T (Karasuyama dkk., 1989; Roitt dkk., 2001b). Di dalam melawan infeksi virus yang berbeda, setiap sub-kelompok sel sel T juga berperan berbeda beda. Pada infeksi lymphocytic choriomeningitis virus, sel sel CD4+ T tidak diperlukan dalam proses penyembuhan (Marker dkk., 1995). Sebaliknya

pada infeksi HIV, penurunan jumlah sel sel CD4+ T menyebabkan disfungsi sel sel CD8+ T, natural killer cells dan sel sel B yang menyebabkan tingginya titer virus pada phase infeksi kronis (AIDS) (Flint dkk., 2004b). Pada infeksi virus lainnya, sel sel CD8+ T berperan penting pada awal infeksi (Jin dkk., 1999; Matano dkk., 1998; Pantaleo dkk., 1997a) dan juga pada stadium kronis yang menandakan sel sel tersebut menghasilkan zat zat antivirus (Copeland dkk., 1995; Migueles dkk., 2002). Dalam studi ini dipaparkan hasil investigasi ekpresi cytokines IL-2, IFN- dan TNF- di dalam sel sel limposit setelah infeksi JDV untuk mengetahui hubungan antara hyperplasia sel sel CD3+ T di dalam jaringan lymphoid dengan peningkatan populasi sel sel CD8+ T di dalam darah selama phase kesembuhan sebagaimana ditunjukan oleh analisa flow cytometri.

MATERI DAN METODE 1.Hewan percobaan dan

pengambilan sample sel sel limposit.

Lima ekor sapi Bali awalnya di inokulasi dengan JDV strain JDVTab/87 sesuai standard. Dari ke lima sapi tersebut sampel darah (limposit) diambil setiap hari selama 19 hari sejak infeksi JDV, menggunakan tabung berisi EDTA (Greiner Bio-One). Di dalam studi ini digunakan dua analisa: flow

cytometri dan real time PCR (RT-PCR).

2. Analisa Flow cytometri Analisa ini dilakukan untuk mengetahui peningkatan atau penurunan sub-populasi limposit di dalam darah. Pertama, dari ke lima hewan percobaan, sel sel limposit di isolasi menggunakan Ficoll-Paque plus (Amersham Biosciences) sesuai protokol dari perusahan, lalu dicuci 2 kali

80


dengan FACS buffer (Dulbeccos phosphate-buffered saline [Thermo Scientific] mengandung 5% heat inactivated foetal calf serum (FCS; Bovogen Biologicals) dan 0.05% sodium azide [Sigma-Aldrich]). Sel sel limposit kemudian dilarutkan ke dalam FACS buffer dengan konsentrasi 1 x 107 cells/ml, dan direaksikan dengan salah satu dari antibodi: 2.5 g/ml mouse anti-bovine CD4 MAb (Serotec), 5 g/ml mouse anti-bovine CD8 MAb (Serotec) atau 20 g/ml mouse anti-bovine CD21 MAb (Santa Cruz), a B-cell marker dengan konjugate An Alexa Fluor (AF488) kemudian di deteksi dengan goat anti-mouse cross absorbed secondary antibody (Invitrogen). Pewarnaan dilakukan dengan teknik single-colour analysis seperti protokol yang dipublikasi (Foster dkk., 2007; Rocchi dkk., 2007). Semua sampel di analisa dengan alat BD CellQuest Pro V5.2 (BD Biosciences) dengan perangkat lunak FACSCalibur. Pengolahan data dilakukan dengan FlowJo V7.2.5 (Tree Star Inc., USA) flow cytometry analysis software. 3. Analisa real time PCR Analisa ini bertujuan untuk mengetahui terjadinya ekspresi cytokines selama infeksi JDV. Sebagian sample limposit dari ke lima hewan percobaan pada analisa flow ctyometri atas, juga digunakan dalam analisa ini. Sampel limposit disimpan pada suhu -80oC sampai isolasi RNA.

3. a. Primers Informasi dan pemilihan oligonucleotide primers untuk gen cytokine IL-1, IL-2, Il-6, TNF-alfa dan IFN-gamma, dan glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) sebagai kontrol internal di dapat dari publikasi sebelumnya (Konnai dkk., 2003; Leutenegger dkk., 2000). Semua sequences oligonucleotide primer (Table 1) di confirmasi memakai program BLASTIN (Zhang and Madden, 1997). Oligonucleotide primers untuk kuantitatif JDV RNA juga di dapat dari publikasi sebelumnya (Stewart dkk., 2005).

3. b. Ekstraksi RNA Total RNA (tRNA) di ekstraksi dari limposit menggunakan kit RNeasy Plus with genomic DNA (gDNA) eliminator columns (Qiagen), sesuai protokol pabrik. Untuk menghilangkan secara total sisa genomic DNA (gDNA), total RNA (tRNA) yang di ektraksi direaksikan dengan 1 Unit DNAase (Promega) per 1 ug tRNA pada suhu 37oC selama 30 min dilanjutkan dengan inaktivasi enzyme dengan DNAase Stop solution pada suhu 65oC selama 10 min. Konsentrasi tRNA yang sudah direaksikan dengan enzyme tersebut kemudian di ukur dengan spectrometer (Nano-drop 1000), lalu di simpan pada suhu -80oC. Prosedur normalilasi digunakan untuk mengkoreksi kesalahan percobaan dan ektraksi RNA, sebagai dilaporkan (Bustin, 2000, 2002; Bustin and Nolan,

81


2004). Untuk setiap reaksi amplifikasi RT-PCR, sejumlah 40 ng /rekasi sample tRNA digunakan sebagai template. Untuk mengetahui titer RNA dari JDV selama infeksi, RNA dari JDV tersebut di isolasi dari sample plasma menggunakan kit QIAamp Viral Mini Kit (Qiagen) sesuai

protokol pabrik. Sample plasma terlebih dulu di sentrifuge (8,000 x g selama 5 min), lalu RNA JDV di isolasi dimana 140 ul plasma dilarutkan dalam 50 ul elution buffer (AVE buffer; QIAGEN), dan di simpan pada suhu -80oC sampai diuji.

Tabel 1. Daftar sequence of oligonucleotide primers untuk real-time RT-PCR.

Gene Primer sequences (5-3) (forward & reverse)

Length Primer(bp)a Product (bp)

IL-2b TTTT TAC GTC CCC AAG GTT AA

CGT TTA CTG TTG CATCATCA

20

20

217

TNF-c TCTTCTAAGCCTCAAGTAACAAGT CCATGAGGGCATTGGCATAC

N/A 103

INF- c TGGATATCATCAAGCAAGACATGTT ACGTCATTCATCATCACTTTCATGAGTTC

N/A 151

GAPDH c GGCGTGAACCACGAGAAGTATAA

CCCTCCACGATGCCAAAGT

N/A 120

JDV pold GGGAGACCCCGTCAGATGTGGA TGGGAAGCATGGACAATCAG

N/A 121

a bp: base pairs b Konnai dkk. (2003).c Leutenegger dkk. (2000). d Stewart dkk. (2005).

3. c. Pembuatan cDNA dari RNA Sebanyak 1 ug sample tRNA di proses untuk membuat cDNA memakai SuperScript III RT (Invitrogen) sesuai protokol pabrik. Sintesis cDNA dibuat menggunakan pasangan primer (Table1), dan hasil PCR nya di sequencing untuk verifikasi spesifisitasnya memakai prosedur sequencing standard (Applied Biosystems 3730 DNA sequencer). 3.d. Cloning cDNA Sampel DNA pasca sequencing di electrophoresis pada gel agorose

2.5 % selama 2 jam pada 65 V. Pita DNA bands di visualisasi dengan pewarnaan SYBR Green (Promega) dan di potong dari gel untuk ektraksi DNA memakai QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) sesuai protocol pabrik. DNA yang sudah di isolasi dan dimurnikan, lalu di clone ke dalam pCR 2.1 memakai TA Cloning System (Invitrogen) sesuai protokol pabrik. Setelah ditransformasikan ke dalam E. coli, koloni warna putih di seleksi dan di tumbuhkan dengan media YT pH 7.2 berisi 10 g bacto-yeast extract, 5 g NaCl

82


dalam 1 l DH2O. Plasmid DNA kemudiam dimurnikan dari sel sel bakteri memakai kit QIAamp DNA Mini (Qiagen) sesuai protokol pabrik. Plasmids kemudian di screening untuk memilih target inserts yang tepat memakai Eco RI digestion (Promega), sesui protokol pabrik. Untuk analisa sequence lebih lanjut dan persiapan curve standard yang diperlukan dalam RT-PCR quantitatif, DNA plasmid di amplifikasi dengan PCR. Singkatnya, 2 ul DNA plasmid di campur dengan 2.5 ul 10X buffer, 1.25 ul of 25 mM MgCl2, 0.2 ul of 2.5 mM DNTPs, 1 ul of 20 pM forward and reverse primers, 0.125 ul Taq polymerase (5.5 unit/ul) yang dibuat menjadi total 25 ul dengan penambahan air untuk PCR. Reaksi PCR dijalankan dengan kondisi: 3 menit denaturasi pada 94oC, 35 cycles , 94oC selama 30 detik, 52oC selama 1 menit, 72oC selama 1 menit, 72oC selama 10 menit, dan lalu 14oC. Setelah visualisasi DNA pada gel agarose, pita DNA di potong dan diektraksi dari gel dan konsentrasinya di ukur dengan spectrophotometer pada 260 nm, dan konsentrasinya di ukur

menjadi 1 ug DNA/ml dan kembali di sequence untuk konfirmasi. 3. e. Persiapan curve standard dan analisa kuantitatif. Untuk mengetahui kuantitas ekpresi cytokine mRNA, diperlukan curve kalibrasi dengan mengukur fluorescence dari dilusi bertingkat (10-fold dilutions) dari 10-2 (0.01 ng/ml) sampai 10-6 cDNA yang konsentasinya sudah ditentukan sebelumnya (1 ug DNA/ml) dan konsentrasi dari sampel yang diuji dibagi nilai curve standard. Berat massa dari setiap plasmid (Tabel 2) dirubah dalam bentuk mole dikalikan dengan nilai Avogadro, untuk mengestimasi jumlah copy setiap cytokines dalam setiap reaksi. Jumlah copy setiap cytokine yang terdeteksi pada setiap reaksi secara otomatis ditentukan memakai perangkat lunak software package (SYBR-green, Corbett Research). Pembuatan curve standard dan analisa regresi di buat memakai program Rotor-Gene (Corbett Research). Curve standard untuk kuantitasi JDV RNA di buat berdasarkan informasi dari publikasi sebelumnya (Stewart dkk., 2005).

83


Table 2. Massa plasmid yang digunakan untuk estimasi jumlah copy cytokine.

3.f. Analisa ekpresi cytokine dari sapi Bali menggunakan real-time PCR RT-PCR dikerjakan memakai alat Rotor-Gene 3000 (Corbett Research) sesuai protokol perusahan. Reaksi RT-PCR memakai pewarna SYBR Green di formulasi dengan mencampur 2 u RNA mengandung 40 ng of DNAase-treated RNA sebagai templet dengan 8 u reaction mix berisi 5 u of 2X SYBR Green RT-PCR reaction mix (Bio-Rad), 1 u of 300 nM of each primer, 0.2 u iScript RT 1 step RT-PCR (Bio-Rad) and 0.8 ul nuclease-free water (Bio-Rad). Reaksi PCR dilakukan duplo dan curve standard di buat triplikat. 4. Analisa Statistik Untuk mengkalkulasi perbedaan kelompok terhadap uji flowcytometri dan ekpresi cytokine, digunakan analisa one-way ANOVA (SPSS 17.0) dan perbedaan di antara waktu pengambila sample sesuai periode perkembangn penyakit JDV, digunakan analisa Bonferronis multiple comparison. Nilai p < 0.05 di nilai sebagai perbedaan yang signifikat untuk semua analisa.

HASIL Analisa flow cytometri. Ada perbedaan yang sangat nyata terhadap jumlah absolute sel sel limposit di dalam 3 katagori phase infeksi: normal (sebelum hewan di infeksi JDV), demam dan awal kesembuhan/ pasca demam. Selama demam total sel sel CD4+ T turun drastis secara signifikan (p

84


Table 3.

Perbandingan sub-set limposit selama 3 periode penyakit Jembrana.

Lymphocyte population Mean absolute number cells/ml SD

Pre-infection Febrile phase Post-febrile T-helper cells, CD4+ 2418 277a 176 171b 45 10 b Cytotoxic T-cells,CD8+ 1210206 b 768489b 3187601 a B-cells, CD21+ 1799 404 b 2065823b 4225 841 a

Gambar 1. Perubahan sub-set limposit pada infeksi JDV. Ada peningkatan suhu tubuh meningkat (garis merah) hari 5-9 pasca infeksi (phase demam) dan jumlah sel sel CD4+ T turun tajam secar signifikan (p

85


Analisa RT-PCR. Persiapan sample RNA Genomik DNA (gDNA) adalah DNA dari sel normal yang sangat pengganggu dalam analisa cytokines yang diisolasi dari sel dan dianalisa secara kuantitatif, karena itu harus di eliminasi. Gambar 2 menunjukan bahwa dengan penambahan 40 ng DNAase per reaksi dapat mengeliminasi total gDNA dari sample tRNA.

Konfirmasi keberhasilan cloning dan sequencing Produk DNA yang di buat dengan pasangan primers cytokine (Table 1) dapat di clone dengan baik ke dalam vector pCR 2.1. A target-inserts dari proses cloning ini kemudian di amplifikasi untuk membuat DNA yang selanjutnya lagi di sequence untuk pembuatan kurve standard (Gambar 3). Analisisa sequence dari produk PCR membuktikan identitas asli dari beberapa cytokines gen sapi dengan tingkat homogenesitas 92% - 100% (Gambar tidak ditampilkan).

Cycle5 10 15 20 25 30 35 40

Nor

m. Fl

uor

o.

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Cycle5 10 15 20 25 30 35 40

Nor

m. Fl

uor

o.

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Gambar 2 Analisa Real-time RT-PCR dari TNF- menunjukkan eliminasi total gDNA dari

sample tRNA . A. Contoh standard curve untuk TNF-, menunjukan kurve yang bagus, linear. B. Sampel tRNA tanpa treatment DNAase (tanda panah kiri) dan tRNA yang di treatment DNAase (tanda panah kanan). Tidak ada PCR produk bila RT tidak ditambahkan dalam reaksi, menandakan gDNA dapat dihilangkan

secara total. Kondisi reaksi dari gen yang lain adalah sama.

A B

86


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gambar 3

Agarose gel electrophoresis produk PCR dari DNA yang di isolasi dari hasil cloning. No. 1 dan 10, 100 bp. DNA ladder (Promega); No. 2, IL-1 (173 bp), No. 3, IL-2 (217 bp), No. 4, IL-6 (236 bp), No. 5, IFN- (151 bp); No. 6, TNF- (103 bp), No. 7, GAPDH (120 bp), No. 8, kontrol primer (IL-1 DNA) dan No. 9, kontrol air. Produk DNA sesuai dengan posisi DNA plasmid constructs.

Gejala klinis, RNA-JDV dan respon cytokine pada sapi terinfeksi JDV RT-PCR digunakan untuk mengkuantifikasi RNA JDV di dalam plasma darah dan ekpresi IL-2, TNF- dan INF-gamma dalam limposit. Salah satu contoh analisa melting curve dari RT-PCR untuk

IFN-gamma dengan koefisien korelasi hampir sempurna (0.998) ditunjukkan pada gambar 4, yang mengindikasikan tingkat spesifisitas yang hampir sempurna, dan hasil yang sama juga di dapat dari semua uji RT-PCR yang digunakan

.

deg.75 80 85 90 95

dF/d

T

3

2

1

0

Gambar 4 Analisa melting curve (kiri) dan koefisien korelasi (kanan) hasil uji

87


RT-PCR untuk ekpresi IFN-gamma dari 1 ekor hewan, menunjukkan puncak tunggal untuk hasil yang sangat spesifik dengan nilai harapan regresi (R) dan gradien (M) yang hampir sempurna, mendekati nilai 1 untuk Regresi (R) dan nilai 4 untuk gradien (M). Hasil yang sama juga di dapat dari semua uji RT-PCR untuk semua cytokine yang di uji. Didapatkan bahwa ada kenaikan RNA-JDV RNA yang sangat signifikan di dalam plasma sesuai perkembangna phase demam dari 4-7 hari setelah infeksi (Gambar 5 A). Puncak tertinggi kadar RNA-JDV terlihat 9 hari pasca infeksi, kemudian menurun sampai dengan tidak terdeksi pasca demam. Ekspresi RNA-IL-2 cukup rendah sebelum dan selama masa demam

tetapi sangat meningkat secara signifikan pasca demam (p

88


38

39

40

41

42

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213141516 1718 1920 21Days post-infection

Mea

n re

ctal

te

mpe

ratu

re

(oC)

0100200300400500600700800

JDV

RNA

x10

6 /m

l

Temperature JDV RNA

A

02468

101214

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19Days post-infection

Mea

n IL

-2

RNA

/ml

0100200300400500600700800

Mea

n JD

V RN

A 10

6 /ml

IL-2-RNA JDV RNA

B

0

100

200

300

400

500

600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19Days post-infection

Mean

TN

F-al

pha

RNA

/ml

0100200300400500600700800

Mea

n JD

V RN

A x10

6 /ml

TNF-alpha RNA JDV RNA

C

02000400060008000

100001200014000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213 14 15 16 17 18 19Days post-infection

Mea

n IN

F-ga

mm

a

RNA/

ml

0100200300400500600700800

Mea

n JD

V RN

A x10

6 /m/

INF-gamma RNA JDV RNA

D

Gambar 5. Ringkasan dari reaksi demam, titer virus dan ekpresi gen dari 5 ekor sapi

yang di infeksi JDV strain JDVTab/87. A. Reaksi demam dan titer RNA-JDV, B. Ekpresi IL-2. C. Ekpresi TNF-, D. Ekpresi IFN- . Hasil ditampilkan berdasarkan nilai rata-rata dari 5 ekor sapi dan error bars serta SD

ditunjukkan.

89


PEMBAHASAN Teknologi real-time RT-PCR yang digunakan dalam penelitian ini sudah digunakan secara luas untuk mendeteksi cytokine secara in vivo pada sapi (Konnai dkk., 2003; Usui dkk., 2007; Waldvogel dkk., 2000). Tekni ini sangat sensitive dan sederhana di bandingkan teknik kuantitatif (Blaschke dkk., 2000; Giulietti dkk., 2001). Ada fakta bahwa INF-gamma protein dalam plasma yang dideteksi dengan standard ELISA berkorelasi dengan ekpresi gen INF-gamma yang di uji dengan RT-PCR (data tidak di publikasi), menandakan bahwa INF-gamma mRNA di trasilasi menjadi protein secara in vivo. Gen GAPDH dipilih sebagai kontrol standard sebagai housekeeping gene secara umum untuk memverifikasi kualitas RNA yang diektraksi dan sebagai pensetandadr uji, dan juga digunakan secara luas sebagai endogenous control gene dalam mengkuantifikasi ekpresi cytokine (Dheda dkk., 2004; Lang and Heeg, 1998). Pro-inflammatory cytokines seperti IL-2, INF-nd TNF- diinivestigasi dalam penelitian ini adalah untuk memverifikasi apabila perubahan ekpresinya berhubungan dengan perubahan patologis pada penyakit Jembrana. Pengujian terhadap gen yang lain terutama IL-1 and IL-6 akan sangat menambah informasi secara komprehensif, akan tetapi gen ini tidak di uji dalam penelitian ini karena keterbatasan waktu. Akan tetapi ekpresi yang sangat signifikan dari cytokines IL-2 dan

INF- sangat berhubungan dengan meningkatnya jumlah sel sel CD8+ T yang terdeksi dengan teknik flow cytometry, menandakan bahwa cytokines tersebut diproduksi oleh sel sel CD8+ T, dan di dalam situasi tidak adanya antibodi sampai beberapa minggu setelah infeksi JDV kejadian ini sangat penting dalam penyembuhan hewan yang menyelamatkan sebagian besar hewan terserang. Peranan jenis sel sel yang lain dalam memproduksi cytokines jenis yang sama adalah juga mungkin, tetapi sangat kecil dari sel sel Th1 CD4+ T, karena jumlah sel sel ini sangat menurun sampai sampai di awal kesembuhan. Tidak diketahui secara jelas mengapa sel sel CD4+ T sangat menurun dalam selama phase demam pada penyakit Jembrana, tetapi pada infeksi HIV, penurunan sel sel CD4+ T sangat dipengahuri oleh IL-2 (Ganusov dkk., 2007; Stapleton dkk., 2009). Akan tetapi walapun ekpresi IL-2 sangat meningkat setelah phase demam pada penyakit Jembrana, jumlah sel sel CD4+ T-cell tetap rendah. Cytokines IL-2 and INF- sangat dikenal dalam pathogenesis penyakit virus lainnya. IFN- utamanya diproduksi oleh sel sel natural killer dan natural killer T sebagai reaksi awal, dan oleh sel sel CD4+ Th1 dan CD8+ cytotoxic ketika spesifik rekasi antigen sudah terbentuk (Schoenborn and Wilson, 2007). Cytokine INF- memegang perana penting dalam proses kekebalan tubuh dengan

90


merangsang fungsi daya bunuh bakteri oleh macrophages dan menstimulir pembentukan/produksi IgG (Harrington dkk., 2006; Schoeborn and Wilson, 2007). Naiknya kadar IFN- selama phase demam penyakit Jembrana dan fungsinya sebagai anti-viral effector function of CD8+ T-cells, sangat berhubunagn dengan penurunan titer RNA JDV selama phase demam (akut). Cytokine IL-2 adalah suatu protein yang bersifat autocrine growth factor dan dihasilkan oleh semua sel sel T pada phase awal pendewasaan dan sangat penting di dalam proliferasi sel sel T, aktifasi macrophages dan cytotoxic CD8+ T-cells, meningkatkan daya bunuhnya (Karasuyama dkk., 1989; Roitt dkk., 2001b). Rendahnya kadar Th IL-2 selama phase demam penyakit Jembrana, dimana titer JDV sangat tinggi, berhubungan dengan jumlah sel sel CD4+ T dan CD8+ T di dalam darah selama periode ini. Sebaliknya naiknya jumlah IL-2 setelah periode demam sangat cocok dengan meningkatnya jumlah sel sel CD8+ T , hal mana mengindikasikan bahwa peranan IL-2 sangat besar dalam meningkatkan sel sel CD8+ T yang penting dalam penyembuhan hewan yang terinfeksi JDV. Peranan TNF-alfa pada penyakit Jembrana tidak jelas. TNF- di percaya berperan dalam cell-mediated immunity atau delayed-

type hypersensitivity, menimbulan gejala reaksi infeksi pada phase penyakit akut, merangsang kematian sel apoptosis dan menghambat replikasi virus. (Abbas dkk., 1996). Pada penyakit Jembrana kadar TNF-alfa sedikit meningkat selama phase demam dan kesembuhan, hal ini yang mungkin menimbulkan munculnya gejala klinis dan menurunkan titer virus pada akhir phase demam, walaupun bukti ini sangatlah minimal.

KESIMPULAN Respon seluler dan ekpresi cytokines yang berperan dalam proses kesembuhan dari infeksi virus penyakit Jembrana telah dilakukan secara komprehensif. Diketahui bahwa, kuantifikasi ekspresi cytokine gen seperti TNF-alfa, IL-2 dan utamanya IFN-gamma sangat berhubungan dengan ekspansi sel sel CD8+ T selama phase demam dan awal kesembuhan. Hal ini menandakan bahwa ekspansi sel sel CD8+ T sangat berperan dalam proses pembersihan JDV dari dalam darah dan menyebabkan kesembuhan sebagian besar hewan yang pernah terinfeksi JDV. Studi lebih lanjut perlu dilakukan untuk mempelajari ekspresi gen cytokine lainnya yang mungkin berperan dalam penyembuhan penyakit Jembrana.

91


DAFTAR PUSTAKA

Abbas, A. K., Murphy, K. M. and Sher, A. (1996). Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 383, 787-793.

Binder, D. and Kundig, T. M. (1991). Antiviral protection by CD8+ versus CD4+ T cells. CD8+ T cells correlating with cytotoxic activity in vitro are more efficient in antivaccinia virus protection than CD4-dependent IL. J Immunol 146, 4301-4307.

Blaschke, V., Reich, K., Blaschke, S., Zipprich, S. and Neumann, C. (2000). Rapid quantitation of proinflammatory and chemoattractant cytokine expression in small tissue samples and monocyte-derived dendritic cells: validation of a new real-time RT-PCR technology. J Immunol Methods 246, 79-90.

Boehm, U., Klamp, T., Groot, M. and Howard, J. C. (1997). Cellular responses to interferon-gamma. Annu Rev Immunol 15, 749-795.

Bustin, S. A. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 25, 169-193.

Bustin, S. A. (2002). Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 29, 23-39.

Bustin, S. A. and Nolan, T. (2004). Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J Biomol Tech 15, 155-166.

Copeland, K. F., McKay, P. J. and Rosenthal, K. L. (1995). Suppression of activation of the human immunodeficiency virus long terminal repeat by CD8+ T cells is not lentivirus specific. AIDS Res Hum Retroviruses 11, 1321-1326.

Corral, L. G., Haslett, P. A., Muller, G. W., Chen, R., Wong, L. M., Ocampo, C. J., Patterson, R. T., Stirling, D. I. and Kaplan,

G. (1999). Differential cytokine modulation and T cell activation by two distinct classes of thalidomide analogues that are potent inhibitors of TNF-alpha. J Immunol 163, 380-386.

Dharma, D. M., Ladds, P. W., Wilcox, G. E. and Campbell, R. S. (1994). Immunopathology of experimental Jembrana disease in Bali cattle. Vet Immunol Immunopathol 44, 31-44.

Dheda, K., Huggett, J. F., Bustin, S. A., Johnson, M. A., Rook, G. and Zumla, A. (2004). Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. Biotechniques 37, 112-114, 116, 118-119.

Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R. and Skalka, A. M. (2004b). Human immunodeficiency virus pathogenesis. In Principles of Virology, 2nd edn, pp. 623-653. Washington, DC: ASM Press. Flint, S. J., Enquis, L. W., Krug, R. M., Rancaniello, V. R. and Skalka, A. M. (2000). Virus Offense Meets Host Defense. In Principles of Virology, 2nd edn. pp. 478-515. Washington DC: ASM Press.

Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K. and Whitton, J. L. (2007). Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol Chapter 6, Unit 6 24.

Ganusov, V. V., Milutinovic, D. and De Boer, R. J. (2007). IL-2 regulates expansion of CD4+ T cell populations by affecting cell death: insights from modeling CFSE data. J Immunol 179, 950-957.

Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R. and Mathieu, C. (2001). An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods 25, 386-401.

Harrington, L. E., Mangan, P. R. and Weaver, C. T. (2006). Expanding the effector CD4 T-cell repertoire: the Th17 lineage. Curr Opin Immunol 18, 349-356.

92


Hartaningsih, N., Wilcox, G. E., Kertayadnya, G. and Astawa, M. (1994). Antibody response to Jembrana disease virus in Bali cattle. Vet Microbiol 39, 15-23.

Jin, X., Bauer, D. E., Tuttleton, S. E., Lewin, S., Gettie, A., Blanchard, J., Irwin, C. E., Safrit, J. T., Mittler, J. and other authors (1999). Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Exp Med 189, 991-998.

Kagi, D., Ledermann, B., Burki, K., Seiler, P., Odermatt, B., Olsen, K. J., Podack, E. R., Zinkernagel, R. M. and Hengartner, H. (1994). Cytotoxicity mediated by T cells and natural killer cells is greatly impaired in perforin-deficient mice. Nature 369, 31-37.

Karasuyama, H., Tohyama, N. and Tada, T. (1989). Autocrine growth and tumorigenicity of interleukin 2-dependent helper T cells transfected with IL-2 gene. J Exp Med 169, 13-25.

Konnai, S., Usui, T., Ohashi, K. and Onuma, M. (2003). The rapid quantitative analysis of bovine cytokine genes by real-time RT-PCR. Vet Microbiol 94, 283-294.

Kristensen, N. N., Madsen, A. N., Thomsen, A. R. and Christensen, J. P. (2004). Cytokine production by virus-specific CD8(+) T cells varies with activation state and localization, but not with TCR avidity. J Gen Virol 85, 1703-1712. Lang, R. and Heeg, K. (1998). Semiquantitative determination of human cytokine mRna expression using TaqMan RT-PCR. Inflammopharmacology 6, 297-309.

Locksley, R. M., Killeen, N. and Lenardo, M. J. (2001). The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell 104, 487-501.

Marker, O., Scheynius, A., Christensen, J. P. and Thomsen, A. R. (1995). Virus-

activated T cells regulate expression of adhesion molecules on endothelial cells in sites of infection. J Neuroimmunol 62, 35-42.

Matano, T., Shibata, R., Siemon, C., Connors, M., Lane, H. C. and Martin, M. A. (1998). Administration of an anti-CD8 monoclonal antibody interferes with the clearance of chimeric simian/human immunodeficiency virus during primary infections of rhesus macaques. J Virol 72, 164-169.

Migueles, S. A., Laborico, A. C., Shupert, W. L., Sabbaghian, M. S., Rabin, R., Hallahan, C. W., Van Baarle, D., Kostense, S., Miedema, F. and other authors (2002). HIV-specific CD8+ T cell proliferation is coupled to perforin expression and is maintained in nonprogressors. Nat Immunol 3, 1061-1068.

Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A. and Coffman, R. L. (1986). Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 136, 2348-2357.

Mossman, S. P., Bex, F., Berglund, P., Arthos, J., O'Neil, S. P., Riley, D., Maul, D. H., Bruck, C., Momin, P. and other authors (1996). Protection against lethal simian immunodeficiency virus SIVsmmPBj14 disease by a recombinant Semliki Forest virus gp160 vaccine and by a gp120 subunit vaccine. J Virol 70, 1953-1960.

Paliard, X., de Waal Malefijt, R., Yssel, H., Blanchard, D., Chretien, I., Abrams, J., de Vries, J. and Spits, H. (1988). Simultaneous production of IL-2, IL-4, and IFN-gamma by activated human CD4+ and CD8+ T cell clones. J Immunol 141, 849-855.

Pantaleo, G., Soudeyns, H., Demarest, J. F., Vaccarezza, M., Graziosi, C., Paolucci, S., Daucher, M., Cohen, O. J., Denis, F. and other authors (1997a). Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during

93


primary HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 9848-9853.

Pantaleo, G., Demarest, J. F., Schacker, T., Vaccarezza, M., Cohen, O. J., Daucher, M., Graziosi, C., Schnittman, S. S., Quinn, T. C. and other authors (1997b). The qualitative nature of the primary immune response to HIV infection is a prognosticator of disease progression independent of the initial level of plasma viremia. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 254-258.

Rocchi, M. S., Anderson, M. J., Eaton, S. L., Hamilton, S., Finlayson, J., Steele, P., Barclay, G. R. and Chianini, F. (2007). Three-colour flow cytometric detection of PrP in ovine leukocytes. Vet Immunol Immunopathol 116, 172-181.

Roitt, I., Brostoff, J. and Male, D. (2001b). Cell-Mediated Cytotocixicity. In Immunology, 6 edn, pp. 163-172. Mosby: Elsiver Limited.

Rosenzweig, S. D. and Holland, S. M. (2005). Defects in the interferon-gamma and interleukin-12 pathways. Immunol Rev 203, 38-47.

Schoeborn, J. R. and Wilson, C. B. (2007). Regulation of Interferon-gamma During Innate and Adaptive Immune Responses. Advances in Immunology 96, 41-100.

Stapleton, J. T., Chaloner, K., Zhang, J., Klinzman, D., Souza, I. E., Xiang, J., Landay, A., Fahey, J., Pollard, R. and other authors (2009). GBV-C viremia is associated with reduced CD4 expansion in HIV-infected people receiving HAART and interleukin-2 therapy. Aids 23, 605-610.

Usui, T., Konnai, S., Ohashi, K. and Onuma, M. (2007). Interferon-gamma expression associated with suppression of bovine leukemia virus at the early phase of infection in sheep. Vet Immunol Immunopathol 115, 17-23.

Waldvogel, A. S., Hediger-Weithaler, B. M., Eicher, R., Zakher, A., Zarlenga, D. S., Gasbarre, L. C. and Heussler, V. T. (2000). Interferon-gamma and interleukin-4 mRNA expression by peripheral blood mononuclear cells from pregnant and non-pregnant cattle seropositive for bovine viral diarrhea virus. Vet Immunol Immunopathol 77, 201-212.

2. Respon Seluler Dan Ekspresi Cytokines Yang Berperan Dalam Kesembuhan Dari Infeksi Virus Penyakit...

Documents

Transcript of 2. Respon Seluler Dan Ekspresi Cytokines Yang Berperan Dalam Kesembuhan Dari Infeksi Virus Penyakit...