Penanganan Awal Sampel Biologis

Senyawa Aktif seperti Obat memiliki peran penting dalam tubuh kita, terutama saat penyembuhan penyakitSampel Biologis adalah sample yg diambil dari sebagian tubuh untuk tujuan analisis , misalnya blood/darah, urine, stomach contents ( including stomach washing and vomit/muntah), liver/hati, bile/empedu, brain, kidneys, meat, hairs, atau bagian tubuh.

Penyiapan sampelPemisahan senyawa dari cuplikan/sampel biologis (urin, darah, feses)Analisis senyawa aktifSpektrofotometri, kromatografi, RIA, dll

Analisis senyawa aktif dalam sampel biologi mempunyai berbagai tujuan:1. Untuk mengetahui/menetapkan adanya atau jumlah senyawa endogenik tertentu: kimia klinik untuk tujuan diagnosa.2. Untuk menetapkan adanya atau jumlah senyawa exogenik ( berasal dari luar tubuh):analisis metabolit, doping, keracunan, kesetaraan dan ketersediaan hayati suatu obat.3. Untuk memantau penggunaan obat baik dalam analisis farmakodinamik, pemantauan maupun kepatuhan pasien

Berbagai kendala perlu diperhatikan dalam analisis senyawa aktif dalam sampel biologi yaitu:1. Kadar analit biasanya rendah, oleh karena itu perlu metode analisis yang sensitif.2. Dalam sampel biologi biasanya mengandung berbagai senyawa baik endogen maupun exogen yang dapat mempengaruhi hasil analisis. Oleh karena itu perlu analisis yang selektif atau dilengkapi dengan teknik pemisahan sebelum dilakukan analisis

cuplikan/sampel biologis

Darah- plasma- serum Urin SalivaDll

SAMPEL DARAH

Pengumpulan sampel darah (phlebotomy) Ada 3 cara:tusukan vena (venipuncture)tusukan kulit (skinpuncture) tusukan arteri atau nadi

Ada dua cara dalam pengambilan darah vena, yaitu cara manual dan cara vakum.Cara manual dilakukan dengan menggunakan alat suntik (syring)sedangkan cara vakum dengan menggunakan tabung vakum (vacutainer).

Yang tidak boleh diambil darahnyaDarah edemaHematomaDaerah dimana darah sedang ditransfusikanDaerah bekas lukaDaerah intravena lines (tempat infus)

Pengambilan Sampel DarahDiambil dari venipuncture (vena)Alat : syringe / vacutainer apparatus / kateter vena Volume sesuai kebutuhan biasanya 5 15 mLMula-mula bagian atas lengan diikat (torniquet) dioleskan antiseptik pengambilan sampel darah dengan hati-hati

Darah vena tepi biasanya diambil dari lekuk siku.Vena punggung tangan juga dapat digunakan, tetapi kurang disukai.

Penanganan Sampel Darah ... pengumpulan, penanganan, penyimpanan, dan penandaan contoh sampel darah yang tepat akan meningkatkan hasil analisis yang dilakukan.sampel harus dianalisis segera atau disimpan dengan teknik penyimpanan yang sesuai prosedur, semakin lama serum/plasma bersentuhan dengan eritrosit, semakin besar penurunan kadar obat

penangananSampel darah jangan digojog karena bisa terjadi hemolisisdarah yang dianalisis dapat berupa : darah total, serum, plasma, fraksi bebas proteinjika obat yang akan dianalisis peka terhadap degradasi enzim, maka segera didinginkan atau degradasi enzimnya.

Secara umum dikenal 4 macam turunan sampel darah vena :Darah total (whole blood)SerumPlasmaFraksi bebas protein

Komposisi darahWhole Blood

PlasmaUnsur-unsur cellular (cell)SerumFibrinogenEritrositLeukositPlatelet (trombosit)

Komposisi darahDarah terdiri daripada beberapa jenis korpuskula yang membentuk 45% bagian dari darah, angka ini dinyatakan dalam nilai hermatokrit atau volume sel darah merah yang dipadatkan yang berkisar antara 40 sampai 47. Bagian 55% yang lain berupa cairan kekuningan yang membentuk medium cairan darah yang disebut plasma darahserum darah atau plasma terdiri atas:Air: 91,0%Protein: 8,0% (Albumin, globulin, protrombin dan fibrinogen)Mineral: 0.9% (natrium klorida, natrium bikarbonat, garam dari kalsium, fosfor, magnesium dan zat besi, dll)Garam

Serum dan Plasma DarahUntuk mendapatkan serum : darah utuh didiamkan 20 menit , disentrifuge kemudian diambil beningannyaUntuk mendapatkan plasma : Darah utuh + antikoagulan disentrifuge, diambil beningannyaPenggunaan plasma untuk analisis lebih sering dipakai karena jumlah obat lebih banyak (bebas & terikat protein plasma)

Plasma = diperoleh dengan menambahkan suatu pencegah penjedalan ke dalam darah.Serum = plasma yg fibrinogennya telah dihilangkan dengan proses penjedalan.Perbedaan plasma dengan serum

Bila darah tidak diberi antikoagulan terjadilah penjedalan, bila diputarkan, maka beningannya adalah serum.

Analisis sampel plasma

darah dikumpulkan dalam tabung yang berisi anti koagulan

Anti koagulan :heparin (garam Na)kalium oksalat (1 mg K2C2O4 / mL darah)

Plasma dan SerumSampel plasma dan serum yang baru saja disentrifugasi akan disimpan, gunakan aturan berikut :Pada suhu kamar, 6 jam, tidak terjadi peru-bahan metabolit atau enzimPada suhu 4 0C, 24 jam , plasma dan serum dapat disimpan tertutup, tanpa perubahanUntuk penyimpanan dalam waktu yang lama, sampel dapat dibekukan atau diliofilisasi (freeze drying)

Sampel Darah

SAMPEL URINE

Sampel UrineUntuk studi obat atau metabolitnya melalui ginjalMudah dilakukan & banyak lama dan selang waktu penampungan urin sesuai dengan karakteristik obat yang akan diujiUmumnya tidak mengandung lipid dan protein, mudah diekstraksi menggunakan pelarut organik.

Pengertian UrinAir seni alias air kencing atau urin adalah cairan sisa yang dilepaskan oleh ginjal, yang kemudian dikeluarkan dari tubuh melalui proses urinasi (berkemih). Ekskresi urin diperlukan untuk membuang molekul-molekul sisa dalam darah yang disaring ginjal dan untuk menjaga kestabilan cairan tubuh.

Ginjal merupakan organ yang penting dalam pengaturan kadar cairan tubuh, keseimbanganelektrolit dan pembuangan metabolit-metabolit sisa dan obat dari tubuh. Kerusakan atau degenerasi fungsiginjal akan mempunyai pengaruh pada farmakokinetika obat. Beberapa penyebab yang umum dari kegagalan ginjal yaitu penyakit, cidera dan intoksikasi obat

cara pengambilan sampel urinUrin sewaktu: urin dikeluarkan pada waktu yang tidak ditentukan secara khusus. Tujuan :Untuk pemeriksaan urin : volume, makroskopi (warna, kejernihan urin) dan urin lengkap.

Urin pagi: urin yang pertama-tama dikeluarkan di pagi hari setelah bangun tidurTujuan :Untuk pemeriksaan sedimen, berat jenis, protein, dan test kehamilan berdasarkan HCG (Human Chorionic Gonadotropin).

Urin postprandial ; urin yang pertama kali dikeluarkan 1,5 3 jam sehabis makan. Tujuan : Sampel ini berguna untuk pemeriksaan glukosuria.

Urin 24 jam: urin yang dikumpulkan selama 24 jam dalam botol besar yang bersih dan diberi bahan pengawet.Tujuan :Untuk menentukan kuantitas suatu zat dalam urin.

Pengujian umumColorClarityOdorSpecific gravity.pHProtein.Glucose.Nitrites.Ketones. Microscopic analysis (Red or white blood cells, Casts, Crystals, Bacteria, yeast cells, or parasites.)

warna urinKuning: Zat warna normal dalam jumlah besar: urobilin, urochrom. Zat warna abnormal: bilirubin. Pengaruh obat-obat: santonin, riboflavin, atau pengaruh permen. Indikasi penyakit: tidak ada (normal).Hijau : Zat warna normal dalam jumlah besar: indikan (indoxilsulfat). Pengaruh obat-obat: methyleneblue, evans blue. Indikasi penyakit: obstruksi (penyumbatan usus kecil).Merah: Zat warna normal dalam jumlah besar: uroerythrin. Zat warna abnormal: hemoglobin, porfirin, porfobilin. Pengaruh obat-obat: santonin, amidopyrin, congored, atau juga zat warna makanan. Indikasi penyakit: glomerulonefritis akut (penyakit ginjal), kanker kandung kencing.

CokelatZat warna normal dalam jumlah besar: urobilin. Zat warna abnormal: bilirubin, hematin, porfobilin. Indikasi penyakit: hepatitis.1. Cokelat tua atau hitamZat warna normal dalam jumlah besar: indikan. Zat warna abnormal: darah tua, alkapton, melamin. Pengaruh obat-obat: derivat fenol, argyrol. Indikasi penyakit: sindroma nefrotika (penyakit ginjal).2. Serupa susuZat warna normal dalam jumlah besar: fosfat, urat. Zat warna abnormal: pus, getah prostat, chylus, zat-zat lemak, bakteri-bakteri, protein yang membeku. Indikasi penyakit: infeksi saluran kencing, kebocoran kelenjar limfa

Penanganan Sampel Urinewadah penampung urine harus inert dan bebas dari bahan pengganggu analisiuntuk menghindari kontaminasi mikroba urin dapat disimpan dalam lemari pendinginuntuk analisi biasanya diperlukan 1015 ml urinehasil penetapan obat dari urine memberi informasi yang penting tentang timbunan obat dalam tubuh

Gambaran yg teramati pd analisa obat dalam urinT obatKec ekskresiKec eliminasi% obat yang di metabolisme% obat yang diekskresi

Sampel Urin

Sampel FesesUntuk studi metabolisme kesetimbangan massa, dan analisis obat dan metabolitnya yang terlihat di empeduMudah & banyakdalam analisis perlu diperhatikan homogenasi dari feses untuk dianalisis selanjutnya

Feses:ditampungmenggunakanalluminiumfoil*Liofilisasi *Banyakprotein *Materialpadatbanyak

Contoh pengujianAlergi atau peradangan di tubuh, untuk evaluasi terhadap alergi protein susu pada bayi.Infeksi, yang disebabkan oleh beberapa jenis bakteri, virus, atau parasit yang menyerang sistem pencernaan.Masalah pencernaan seperti malabsorpsi tertentu seperti gula, lemak, atau bahan gizi lainnya.Perdarahan di dalam saluran gastrointestinal.

Sampel SalivaOrang normal mampu memproduksi saliva lebih dari 2 L dalam sehari.Sebagai alternatif jika tidak memungkinkan mengambil darahMengandung obat dalam bentuk tidak terionisasi & tidak terikat proteinTratmen untuk analisis lebih mudah dan sederhana.

Pengambilan Sampel Saliva

Dlmfarmakokinetikklinik:monitoringdanpenetapan aturandosistheofilindilakukanmonitoringkadarobatdalamdarahdenganmenggunakansamplesaliva.Saliva:harusdiketahuirasiokadarsaliva/plasmaBbrpobatdiketahuiratiokadarsaliva/plasmakonstanJumlahobatyg diekskresikan kesaliva berhubungan dengan derajadionisasidlmpHfisiologis danprotein-bindingBentuk obat takterionkanakanterdapat paling banyakTerapetikindekteofilinsangatsempit

Deproteinisasi

Bagian darah yg tertinggal setelah komponen sel & protein plasma dihilangkan. Fraksi ini mengandung bahan yg tidak terikat pd protein plasma (elektrolit, glukosa, dll). Pengukuran kadar obat dalam fraksi bebas protein berguna untuk menentukan senyawa bebas dan yang terikat pd protein. Fraksi ini didapat dengan cara ultrafiltrasi, yg membiarkan air dan molekul kecil menerobos lewat penyaring, sedangkan molekul besar (albumin dan globulin) tertahan.

Deproteinisasi

Mengapa Sampel Perlu Di-Deproteinisasi

? ? ?

Deproteinisasi

Metode yang paling umum digunakan adalah : Pengendapan protein sebagai garam yang tidak larut

Pengaruh pH Protein

pH rendah ( asam kuat ) pH tinggi ( basa kuat )

muatan positif muatan negatif

Pengaturan pH

Sampel (protein)Sampel (protein)

pH larutan titik isoelektriktitik isoelektrik

protein sbg kationprotein sbg anion

bereaksi dng anion ttt. membentuk garam tak larutbereaksi dng kation ttt. membentuk garam tak larut

Precipitating Agents

AnionikKationik

pikratIon-ion logam berat spt. :

molibdattungstatsulfosalisilatmetafosfatperklorattrikloroasetat-------seng merkuri Kadmiumuraniumbesitembagatimbal(Zn)(Hg)(Cd)(U)(Fe)(Cu)(Pb)--ZnSO4ZnSO4/Ba(OH)2

Titik Isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu di mana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik. Pada pH isoelektrik (pI), suatu protein sangat mudah diendapkan karena pada saat itu muatan listriknya nol.

Protein akan mengalami perubahan muatan pd pH di atas & di bawah titik isoelektriknya. Pada pH di bawah TI muatan positifnya lebih besar, sedangkan di atas TI muatan negatifnya lebih besar. Perubahan muatan menyebabkan menurunnya daya tarik menarik antara molekul protein shg molekul lebih mudah terurai. Semakin jauh perbedaannya dari TI maka kelarutan protein semakin meningkat.

Deproteinisasi dgn dehidrasiBila sejumlah tertentu air

dihilangkan dari protein

Protein akan mengendapSENTRIFUGASI

Deproteinisasi dengan cara dehidrasi

Solvent ( suhu rendah )AsetonitrilAsetonMetanolEtanol

(menarik mantel air yg melingkupi molekul2 protein) Salting out ( protein pada titik isoelektrik )+Garam( Na sulfat, Na sulfit )

Protein mengendap

Salting out :kebanyakan protein tidak larut dalam larutan garam pekat & mengendap atau didesak keluar dari larutan dalam keadaan tidak berubah. Prinsip ini digunakan utk memisahkan protein dari darah.

Karakteristik cairan pelarut untuk mempersiapkan sampel biologis untuk proses ekstraksi

Alat yang digunakan dalam bioanalisisTersedia dan terjangkauSesuai untuk sampel maupun senyawa yang dianalisisSelalu dikalibrasi dengan baikTerawat dan memiliki performa yang baikTujuannya :data yang dihasilkan dari alat reliabeldata tidak hilang atau menghasilkan data yang inaccurate

Sampel biologisSalivaperludipertimbangkansebagaisampelyg idealmengingatpengambilannyatidakinvasiv dengansyaratapabilakadarobatdalamsaliva menggambarkankadarobatdalamdarah.Cairancerebrospinaljugadapatdigunakansbg sampel,utamanyauntukobat yang bekerja diCNS, mengingat kedekatan fisiologisdengan organtarget, yaituotakSampelhayatiyangjarangdianalisiskandungan obat/metabolitnyaadalahempedu,keringat,airsusu, airmata.

BeberapapermasalahandengansampelbiologisPemisahan/isolasianalit: Mudah-tidaknya sampeldianalisissebanding dengan fluiditasnya.Cairancerebrospinalpalingmudahditangani, sedangdarahutuhdanjaringanorgan/paling sulitUntukmeningkatkanfluiditas,sampelhayatiyg solidatausemisolidseringkalimengalami prosesmekanis,misalnyahomogenisasidll

StorageforBiologicalSamplesUntukmenghindaridekomposisidanperubahankimialainBilaobat/metabolitsensitifthd esterase:pendinginanpd6Cdanatau penambahanNaFpadasample ygmengandung eritromosisinpropionatApomorfin:pekathdoksidasiolehO2diudara. Pendinginanpada15Cmencegahterbentuknyaquinonsd4minggu,pendinginanselanjutnya tdkmenjaminterjadinyadekomposisikecuali denganpenambahanas.askorbatPendinginan/pembekuan:mempertahankan stabilitasL-DOPAsampai16hari

Plasmadanserummemerlukansentrifugasi dalam prosesperolehannya,Vacutainer tube mengandung silikon yangmemudahkan memisahkan serum/plasma daricorpusculiTabungpalstic(Ependorf)biasanyamengandung esterftalatsbgplasticizerdanesterfosfat: dapat menggangguanalisisAntikoagulantbiladiperlukan:sitrat,heparin, EDTAdll(selamatidakterjadiinteraksidengan analit)Pembekuan/frozensegerasetelahpengambilansampel sering kalitidakdimungkinkan; pendinginan sementara denganesdianggap cukupsebelum dipindahketempat penyimpanan dalamsuhu beku

Kontroltemperaturpenyimpanan:Kklorazepatakan mengalamidekarboksilasimenjadinordiazepamyang dipengaruhiolehsuhudanpHWadahpenyimpanan:wadahgelaslebihdisukaisebab kemungkinanberkurangngnyaanalitdanadanya plasticiserbiladgplastikNitrogliserinterabsorpsiolehwadahplastik,adabbrp obatyg dapatterabsorpsiolehwadahgelas: dptdiatasidengansililasiPlastikpunyakelebihantidakmudahpecah,dalam pengangkutanlebihdisukaiDalambanyakhalperluverifikasidenganspiked biologicalsampleutkmengetahuipengaruhwadahdanpenyimpanan

konsentrasi obat adalah elemen penting untuk menentukan farmakokinetiak suatu individu maupun populasi konsentrasi obat diukur dalm sampel biologis seperti air susu, saliva,plasma dan urin. Sensitivitas, akurasi, presisi dari metode analisis harus ada untuk pengukuran secara langsung obat dalam matriks biologis. Untuk itu metode penetapan kadar secara umum divalidasi sehingga informasi akurat didapatkan untuk dimonitoring farmkokinteika dan klinik.

obat dalam bentuk aktifnya harus berinteraksi dengan reseptor atau tempat aksi atau sel target,dengan kadar yang cukup tinggi. Sebelum mencapai reseptor, obat terlebih dahulu harus melalui proses farmakokinetik. Fasa farmakokinetik meliputi proses fasa II dan fasa III. Fasa II adalah proses absorpsi molekul obat yang menghasilkan ketersediaan biologis obat, yaitu senyawa aktif dalam cairan darah yang akan didistribusikan kejaringan atau organ tubuhFasa III adalah fasa yang melibatkan proses distribusi, metabolisme dan ekskresi obat, yang menentukan kadar senyawa aktif pada kompartemen tempat reseptor berada

*************************************************************