5/7/2018 1

1/7

ISOLASI GEN PALMITOYL-ACPTHIOESTERASEPADA KELAPA SAWIT (Elaies guineensis Jacq.)

Isolation ofPalmitoyl-ACP Thioesterase Gene on Oil Palm(Elaies guineensis Jacq.)A. Sukariawan', A. Purwantoro" dan C. Utomo"Program Studi Agronom iSekolah Pascasarjana U niversitas G adjah M ada

ABSTRACfPlant quality improvement, as a source of oil, was one of the objective ofoil palm plant breeding program, such as genetic engineering. Palmitoyl-ACP thioesterase (PAT) gene was an enzyme code, which influenced the

synthesis of palmitic acid, where its existence was unexpected in crude palmoil (CPO), due to its negative impact on human health. The first step in ge-netic engineering was isolating the gene which related to the plant's nega-tive trait. The gene silencing phase was expected to avoid the expression ofgene PAT, to reduce the proportion of palmitic acid as well as increasing thecontent of oleic acid, which was expected to present in CPO.The aim of the research was to identify nucleotide sequence of the PATgene of the oil palm. The procedure of the research included, extraction theDNA from leaves, gene isolation through specific primer design and ampli-fication, cloning the PAT gene including ligation and transformation, a se-ries of confirmation and verification, and PAT gene sequencing.The result showed that 2 fragments of DNA had been isolated by using2 different pair of primers, they was PAT I and PAT II fragment. PAT I genefragment was amplified by using PAT II and PAT TF primers. Recombinantplasmid carrying PAT I gene fragment had been produced through cloning,ligation and transformation inside the strain of DH5a Escherichia coli. Thetargeted fragment inside the plasmid then was sequence and producing 1,063bp fragment. 750 bp length PAT II gene, was amplified by PAT U and PATURprimer.Keywords: Palm itoy l-ACP thioesterase gene, Elaeis guineensis Jacq., isolationc loning, and sequenc ing.

1 . L em baga Pendidikan Perkeb unan, M edan2 . F akultas Pertanian U niversitas G adjah Mada, YOglJakarta.3 . Indonesian O il Palm R esearch Institute, M edan.

97

5/7/2018 1

2/7

98 AGROSAINS, 19 (2),APRIL 2006 A. Sukariawan,dkk .., Isolasi Gen Palmitoyl-ACP Thioesterase ... 99PENGANTAR

Kualitas minyak menjadi salah satu target dalam pemuliaan tanamankelapa sawit, sasarannya adalah menghasilkan tanaman unggul yangmemiliki kandungan crude palm oil (CPO) dan asam lemak tak jenuh(ALTJ)tinggi.Kelapa sawit komersial Elaeis guineensis yang dikenal sebagai tipetenera (hasil persilangan tipe dura dan pisifera) memiliki keunggulanberupa produktivitas dan kandungan CPO yang tinggi. Namun,komponen penting seperti kandungan ALTJumumnya rendah (Asmonodkk., 1999). Persilangan konvensional untuk tujuan perbaikan kualitasminyak antara Elaeis oleifera dan Elaeis guineensis telah dilakukan sejaklama oleh Pusat Penelitian Kelapa Sawit, tetapi lamanya siklus generatifdan terjadinya segregasi dalam persilangan menjadi kendala utama dalamprogram pemuliaan secara konvensional ini.Sebagai andalan subsektor perkebunan, kelapa sawit adalahpenghasil minyak potensial yang mengandung beberapa jenis asamIemak. Lima asam lemak utama minyak kelapa sawit dan proporsikandungannya yaitu asam miristat (CI4) 1,5-2,5%;asam palmitat (CI6)41-43%; asam stearat (CI8) 4-7%; asam oleat (CI8:1) 38-40%dan asamlinoleat (CI8:2) 9-11% (Anonim, 1999). Keberadaan asam lemak jenuhkhususnya asam palmitat (CI6:0) merupakan hal yang tidak diinginkanbagi kesehatan manusia karena berpotensi meningkatkan kolesterol lowdensitu lipoprotein (LDL) darah yang berpotensi meningkatkan resikokardiovaskular dan penyempitan pembuluh darah. Tingginya kandungan

asam palmitat ini menjadi hambatan persaingan dengan minyak nabatiyang lain.Biosintesis asam lemak pada tanaman menurut Corley and Stratford(1998) seperti yang tertera pada gambar 1. menjelaskan bahwapeningkatan asam oleat (sebagai derivat asam lemak yang lebih sehat)dapat dilakukan melalui peningkatan aktivitas KAS-II dan menekan

aktivitas palmitoy I ACP-thioesterase (PAT) untuk mengurangikandungan asam palmitat atau melalui keduanya (Corley and Tinker,2003).Selain melalui metode konvensional, rekayasa genetika adalah carapeningkatan kualitas minyak guna mencapai sasaran pemuliaantanaman kelapa sawit. Sasaran awalnya adalah isolasi gen PAT(palmitoyl-ACP thioesterase), salah satu gen penentu karakter kualitasminyak karena merupakan penyandi enzim yang berperan dalam sintesisasam palmitat. Karakterisasi gen berupa analisis urutan nukleotidapenyusun gen tersebut dilakukan sebagai langkah awal program tersebut.

Kloning DNA serta serangkaian konfirmasi dan verifikasidiperlukanuntuk membuktikan kebenaran isolasi gen yang dilakukan.

CI4-ACP! KASH. . . . CIS-ACP

!SAT

CISAsam stearat

c59-desalurase o12-desalurase ,., CIS:I-ACp , ClS:2-CoA

!OAT

CIS:IAsam oleat

C18:2Asam linoleat

CI6-ACP!ATC16

Asam palrnitat

Gambar 1. Alur sintesis asam lemak pada tanaman. Angka di belakanghuruf C merupakan jumlah atom karbon dalam asam lemak;KAS-II : 3-keto-acyl-ACP synthetase; ACP : acyl carrier pro-tein; PAT, SAT, OAT dan LAT adalah enzim-enzim yangmengkatalisis masing-masing biosintesis derivat asam lemak

Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh sekuen/urutan genpalmitoyl-ACP thioesterase (PAT) dari tanaman kelapa sawit. Dengangen tersebut diharapkan dapat melakukan penghambatan ekspresimelalui metode antisense (gene silencing) dengan harapan terjadiperubahan komposisi asam lemak khususnya peningkatan asam oleatpada tanaman transgenik yang dihasilkan (Corley and Tinker, 2003).BAHAN DAN CARA PENELITIANEkstraksi dan purifikasi DNA genom

DNA genom kelapa sawit diisolasi menggunakan metode CTAByang dikembangkan oleh Orozco Castillo dkk, (1994)dengan modifikasiberupa penambahan PVPP dan merkaptoetanol sebagai antioksidandalam buffer ekstraksi. Purifikasi hasil ekstraksi dilakukan menggunakanmetode Moller dkk. (Utomo,2002).Penggabungan (2-3sampel), purifikasimenggunakan KIAAdan amonium asetat dilakukan melalui sentrifugasi.Penetapan kuantitas dan kualitas dilakukan melalui pengukuranabsorbansi dan visualisasi pada gel agarose.IsoIasi gen palmitoyl-ACP thioesterase (PAT)

Langkah pertama yang dilakukan untuk mengisolasi sebuahgensetelah mendapatkan DNA genom adalah merancang primer spesifik.

5/7/2018 1

3/7

1U U AGROSAINS , 19 (2), A PR IL 2 00 6 A. Suka r iawan , d kk . ., Isolasi Gen Palmitoyl-ACP Thioesterase ... 1 0 1garam dengan menggunakan membran dan sentrifugasi (Anonim,2002a). Setelah purifikasi, produk PCR siap dikloning setelah terlebihdahulu divisualisasi pada gel agarose.

Disain primer disusun berupa oligonukleotida berdasarkan susunannukleotida/ asam amino yang diambil dari database Genbank (N C B1 se -q u en ce v iewer ) dengan nomor akses AF147879 (1.813bp) dan AF424808(1.385 bp). Primer fonvard dirancang berdasar sekuen nukleotida daridatabase genbank, sedangkan primer reverse dirancang berupa pasangan(komplemen) nukleotida dengan susunan terbalik. Primer spesifik (for-ward dan reverse) inilah yang digunakan untuk mengisolasi gen melaluiamplifikasi dengan meta de PCR ( po lym e ra se c ha in r ea c ti on ).Tabel 1. Disain 8 primer guna isolasi gen PAT. Primer fonvard (PAT 1,PAT 1.1, PAT TF, PAT 2.1F, dan PAT D) serta Primer reverse(PAT 2, PAT 2.1 dan PAT DR) beserta urutan nukleotidapenyusunnya.

Kloning gen (DNA target)Bakteri/prokariot yang digunakan dalam transformasi/kloningadalah E s ch er ic hi a c ol i strain DH5a. yang diperoleh dari BPPT Jakarta.Agen pembuat sel kompeten yang digunakan adalah MgC~ 6HzO 100mM, CaCl2 2HzO 100 mM dan csci, 2H20100 mM + 15 % gl~serol(Panganiban, 1995). Setelah perlakuan sel kompeten, tabung biakandiinkubasi dalam freezer - B o a c atau dimasukkan dalam tabung/ termos

yang berisi nitrogen cair dan bakteri siap ditransformasi.Setelah diperoleh sel kompeten, selanjutnya melakukan reaksi ligasi

untuk membuat plasmid rekombinan. Ligasi (reaksi penggabungan)dilakukan dengan memasukkan 3 fll produk PCR (hasilpurifikasi); 1,5 flllarutan garam NaClz dan MgC~ dan 0,5 IIIvektor pCR4-TOPO (TOPOc lo nin g k it) dalam tabung eppendorf 0,2 m1 dan diinkubasi selama 5-30menit pada suhu ruang. Plasmid ligasi (sirkular) selanjutnya ditrans-formasi dalam 100 fll bakteri kompeten dengan kejutan panas ( h ea t s hocktreatment) 42C selama 30-60 detik (Anonim, 2003).Konstruksi plasmidsirkular (hasil reaksi ligasi tersebut) tersaji pada gambar 2.

Konstruksi pCRiIl 4-TOPOiIl 3954 bp

Nama Primer Jenis Primer Urutan nukleotidaPrimer PAT 1 Forward 5' ATC TIT GGT CIT TCA TIC CCC CCT ' 3Primer PAT 2 Reverse 5' ACCAATCAAAAACTAATI ATGGTI '3Primer PAT 1.1 Forward 5' ATGGTI GCT TCG ATI GCC GCT TGC '3Primer PAT 2.1 Reverse 5' T GC ACTACC ACC TGGAGT TGG CCC '3Primer PAT-TF Forward 5' T IC TATAATCAA TIG CCTGAC TGG '3Primer PAT 2.1F Forward 5' TGAT CTGGG TIG TCA CCA AAA TGC '3Primer PAT U Forward 5' ATGGTNGCT WSGATHGTNGCT '3Primer PAT UR Reverse 5 ' CAT CCC CCC AGG AAG GAT AGT GCT '3

Amplifikasi DNA menggunakan mesin PCRCampuran (mix) PCRdibuat dalam tabung 0,2m1berupa 2,5J..lIufferreaksi; 1,0-2,5 fll MgC~ 25mM; 2,5 IIIdNTP mix 10mM; 2,0 J..lIprimer 1J..lM;2,0 J . . L l DNA [50 ng]; Ta q polymerase 0,2-0,4 J..lIdan ddH20hinggavolume 25 fll.Amplifikasi dilakukan di dalam G en eA mp P CR , dengan setting pro-gram meliputi heating 94C 2 menit; dilanjutkan berturut-turut tahapdenaturasi 94C1-2 menit; annealing 50-60C (30-60detik) dan ekstensi72C(30-120detik) sebanyak 25-40 siklus, kemudian ekstensi akhir 72C

selama 5-10menit dan kondisi akhir (stabil) 4C.Purifikasi produk PCR (hasil amplifikasi)

Protokol Q IA qu ick P urification K its (QIAGEN) digunakan untukpurifikasi fragmen DNAhasil PCR guna menghilangkan sisa primer,primer dimer, nukleotida (sisa dNTPs), enzim polymerase dan garam-

Keterangan :1 . P Io c :2 . LacZa. - ccdB, t erdi ri :

- k od on I ni si as i L ac ZI l- s it us p ri m er M 13 forward- s it us p ri m er M 13 reverse- d ua s it us r es tr i k s i f eo Rl

3. Kanamycin4 . AmpiCi l li n5 . pUC ori6. Produk PCR (gen PAT)

Gambar 2. Konstruksi plasmid pCR4-TOPO beserta situs klaning yangterletak pada gen LacZa-ccdB yang menjadi lokasi penyisi-pan gen target (Ananim,2003)

5/7/2018 1

4/7

Pengamatan dan verifikasi bakteri transformanBakteri transforman akan tumbuh sebagai koloni dalam media LBAmp sebagaimedia seleksi.Kolonibakteri diberi tanda/ nomor, diverifikasimelalui amplifikasi menggunakan primer M13fonoard dan reverse untukmenentukan bahwa penyisipan gen target ke plasmid telah terjadi.Verifikasi kebenaran reaksi kloning (ligasidan transformasi) tersebutdilakukan dengan menggunakan teknik PCR.Komponen PeR-mix terdiridari 2,5 III buffer; 1,5 IIIMgCI2;2,5 III dNTP; primer (fonvard dan re-verse) yang digunakan M13F dan M13R masing-masing 0,5 Ill. Enzimpolymerase yang digunakan adalah Taq polymerase (platinum) 0,2 IIIdan ditambahkan akuades 15,3 Ill. Sampel positive transformant (kolonibakteri) diambil menggunakan tusuk gigi stem dan dimasukkan dalamcampuran PCR yangtelah disiapkan. Setting program PCR diawalidengan heating 94C2 menit, dilanjutkan 25siklus tahap denaturasi 94C45 detik, annealing 60C50 detik dan ekstensi 72C1 menit, kemudianekstensi akhir 72Cselama 5 menit dan diakhiri dengan 4C.

HASIL DAN PEMBAHASANEkstraksi dan purifikasi DNA genom

Konsentrasi dan kemurnian DNA genom (sebagai template) sangatmenentukan keberhasilan isolasi yang dilakukan. Dari hasil ekstraksidiperoleh DNA yang masih tinggi tingkat kontaminan berupa senyawapolifenol, protein dan polisakarida dengan indikasi adanya smear(bayangan). Kontaminan inimenu rut Rogers dan Bendich (1988) akanmempengaruhi keberhasilan isolasi yang dilakukan. Purifikasi yangdilakukan mampu mengurangi kontaminan sehingga kemurnian DNAmeningkat. Basil ekstraksi sebelum dan setelah purifikasi 3 sampel DNAtersaji pada Gambar 3.

~~ :=L,l1;Jeterminasi,Konfirmasi dan Sekuensing DNA Target

Sel transforman yang telah diverifikasi melalui PCR dan elektrofo-resis, dari koloninya diinokulasikan menggunakan jarum ose ke dalam25ml media LBcair ampisilin, kemudian diinkubasi 3~C selama 18jam(over night), selanjutnya dilakukan pemanenan bakteri untuk diisolasiplasmidnya. Guna mengetahui keberhasilan isolasi plasmid, terlebih duludivisualisasi pada gelagarose. Konfirmasi dilakukan melalui pemotonganplasmid menggunakan enzim restriksi EeoRI, guna membuktikan telahdihasilkanplasmid yang membawa gen target.Terdapat 2 situs restriksi EeoRI yang terletak di dekat ujung plasmidvektor pCR4-TOPO, hal ini memungkinkan plasmid rekombinanpCR4::PATdapat terpotong menjadi dua, yaituvektor (PCR4)dan produkPCR (genPAT)melalui penambahan enzim EeoR! (5-10unit) dan inkubasi3~C selama 1 jam.Plasmid transform an hasil isolasi adalah plasmid sirkular yangmengandung DNA target yaitu gen palmitoyl (PAT). Plasmid iniselanjutnya disekuen guna mengetahui urutan nukleotida fragmen DNAhasil isolasi dengan menggunakan primer universal M13 fonoard danM13 reverse. Urutan nukleotida yang terbaca sebagai hasil sekuensingmerupakan nukleotida fonoard dan reverse, oleh karena itu sekuen re-verse harus di-inverse dan dibalik susunannya sehingga pembacaan totalfragmen dapat dilakukan dari depan (fonvard).

1 2 3 4 5 6 7 8Gambar 3. Visualisasi DNA genom kelapa sawit; lajur 1:1 KbPlus DNAladder, lajur 2-4 adalah 3 sampel DNA sebelum purifikasi;lajur 5 marker A . I HindIII; lajur 6-8 adalah sampel DNA se-sudah purifikasiIsolasi Gen Palmitoyl-ACP Thioesterase Berbasis PCR

Kombinasi primer yang dicobakan memberikan hasil berupa ftagmenatau band yang berbeda seperti tersaji pada Tabel 2 dan Gambar 4.Terdapat dua pasangan primer (F dan G) yang memberikan hasil yangcukup konsisten pada beberapa optimasi ~CR berupa fragmen tuaggal,yang lain menunjukkan fenomena polimorfis, seperti yang tertera padaTabel2 dan Gambar 4 tersebut.

5/7/2018 1

5/7

104

Tabel 2. Kombinasi primer guna isolasi gen PAT dan hasil amplifikasidengan metode PCRKOMBINASI PRIMER HASIL AMPLIFIKASI

(FORWARD DAN REVERSE)A PAT 1 dan PAT 2 polimorfisB PAT 1.1 dan PAT 2.1 polimorfisC PATTFdanPAT2.1 polimorfisD PAT 1 dan PAT 2.1 polimorfisE PAT 1.1 dan PAT 2 polimorfisF PATTF dan PAT 2 band tunggalG PATU danPATUR band tunggalH PAT 2.1F dan PAT 2.1 polimorfis

I 2Kb. I ~

Ml ABC Ml D E F M2 G HGambar 4. Visualisasi fragmen DNA hasil amplifikasi beberapa kombi-

nasi primer, M1 : marker A/HindIII DNA ladder; M2 : 1 Kb.DNA ladder; A, B,C, D,E,F,G dan H :fragmen hasil ampli-fikasi menggunakan kombinasi primer sesuai Tabel 2Banyak variabel berpengaruh terhadap keberhasilan dan efektifitasamplifikasi berbasis PCR, termasuk terjadinya fenomena polimorfis.

Variabel tersebut menurut Reece (2004)meliputi kesesuaian antar primer(forward dan reverse), kesesuaian primer dengan template, kemampuanTa q polymerase dalam sintesis DNA dan kemurnian DNA template yangterkait dengan komposisi campuran (mix) PCR dan setting program PCRyang dicobakan.

Dalam mengamplifikasi fragmen DNA menggunakan PCR, enzimpolymerase yang digunakan adalah Ta q polymerase, enzim tersebutdiisolasi dari bakteri Thermus aquat icus yang tahan dan tetapfungsionalterhadap temperatur tinggi. Enzim Taq polymerase ini memilikikeistimewaan (spesifikasi) menghasilkan fragmen atau produkamplifikasi dengan overhang A pada kedua ujung 3' DNA jalin gandayang dihasilkan (Reece, 2004).Melalui optimasi komposisi komponen reaksi dan setting programPCR, diperoleh band tunggal dengan panjang sekitar 1.100 dan 750 bptanpa smear (bayangan) dan polimorfis. Polimorfis atau munculnya bandlebih dari satu akan menjadi kompetitor bagi gen target dan mengurangiefisiensi kloning (reaksi ligasi) atau dengan kata lain gen target menjaditidak spesifik. Untuk memastikan spesifitas gen target, perlu dilakukanpurifikasi produk PCR terutama untuk menghilangkan sisa buffer, ion-

ion kontaminan serta membuang primer dimer yang terbentuk pada saatreaksi berlangsung.

Gambar 5. Visualisasi fragmen DNA hasil amplifikasi menggunakanprimer PAT TFdan PAT 2 (Iajur 1-7);M adalah marker 1 Kb.DNA ladder. Lajur 8-13 menggunakan primer PAT U danPAT UR; Lajur 8-9 hasil amplifikasi dengan suhu annealing59C; lajur 10-11 suhu annea li ng 5~C dan lajur 12-13 suhuannealing 55C

Kloning DNAVektor pCRA4-TOPO dalam reaksi kloning memberikan overhangtimin (T) pada ujung 3' plasmid linear, sementara Ta q polymerase

5/7/2018 1

6/7

memberikan sebuah adenosin (overhang A) pada ujung 3' produk PCR(Anonim, 2003).Vektor TOPO Invitrogen dirancang linier dan diaktivasidengan enzim topoisomerase I Ssuaiguna ligasi produk PCR yangdiamplifikasi oleh Ta q polymerase (Reece, 2004).Melalui reaksi dengan pCRli4-TOPO, dapat secara langsung melaku-kan seleksi re~ombinan melalui mekanisme perusakan gen letal ccdB yangmenyatu (fUSI)dengan .fragmen lacZa.dalam plasmid vektor. Ligasi PCRpro.duk dala~ plas~md merusak ekspresi dari fusi gen lacZa.-ccdB,sehingga apabila f~.sIgen ters~but telah tersisipi fragmen, maka sel yangmembawa plasmid rekombman akan tumbuh, karena bakteri telahkehilangan sifat letalnya.Koloni bakteri yang tumbuh setelah reaksi ligasi dan transformasidipilih dan diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer M13 for-ward ~an reverse ~n~k menentukan bahwa penyisipan gen ke dalam

plasmid telah terjadi. ~erdasarkan hasil PCR dari 5 sampel bakteri(Gamba~ .6), ~ernyata dIperol~h satu koloni bakteri rekombinan yangteramplifikasi gen target sekitar 1.100 bp., dua sampel teramplifikasif~agmenseki~~ 20~bp ( fa ls e po si ti v~ r ecomb inant ) dan dua sampellainnyatidak teramplifikasi fragmen spesifik.

FragmenPrimer dimer

Gambar 6. Visualisasi produk PCR de- Gambart:lgan sampel bakteri hasilkloning, M: marker IKb.DNA ladder, lajur 1-5 sam-pel produk PCR.Lajur 3 ada-lah fragmen transformanyang diharapkan, lajur 2dan 4 adalah fragmen plas-mid rekombinan yang ber-asal dari primer dimer

Vektor

7. Visualisasi plasmid hasilkloning gen palmitoyl,lajur M:marker lKb DNAladder, lajur A adalahplasmid rekombinan sirku-lar (sekitar 5 Kb.). Lajur Badalah hasil pemotonganplasmid rekombinan 2 JlIdengan 2 JlI enzim restriksiEcoRI

.~, n.~vUN..............",__...., --_ .....-- ........_-..................J '" " . ._ . .. . .. .. .. .. ._ - . ; J P . . " " '. .u;;J- .0 J.U/Berdasarkan verifikasi terhadap plasmid rekombinanmenggunakanenzim restriksi EcoR! terbukti (melalui visualisasi pada gel) plasmid hasilkloning merupakan plasmid rekombinan yang terbentuk dari ligasi vektorpCR4-TOPO (sekitar 4 Kb.) dan gen targetfgen palmitoyl (sekitar 1.100bp.). Visualisasi dari pengujian ini tertera pada Gambar 7.5etelah melalui rangkaian konfirmasi dan verifikasi terhadapplas-

mid rekombinan yang membawa gen target (palmitoyl I) selanjutnyaplasmid ini disekuen untuk mendapatkanurutan nukleotida penyusungen palmitoyl. Pada fragmen gen palmitoyl IIyang teramplifikasimenggunakan primer PAT D dan PAT DR juga diyakini sebagai gentarget yang diperoleh sebagai hasil isolasi, meskipun belum diverifikasi.Keyakinan ini didasari oleh konsistensinya yang cukup tinggi pada saatamplifikasi menggunakan mesin PCR. .Setelah dilakukan sekuensing, gen palmitoyl (PAT) Imemiliki

panjang nukleotida 1.063bp (48nukleotida diantaranya adalah sepasangprimer yang mengamplifikasinya), sekuen PATIputative) tersebut tersajidalam lampiran.Kesimpulan1. Terdapat dua pasangan primer dari 8 kombinasi primer yangdicobakan yang mengamplifikasi fragmen tunggal sebesar 1.063 bpdan sekitar 750 bp yang diduga sebagai gen palmitoyl-ACPthioesterase (PAT).2. Gen PAT (putative) terisolasi dan tersekuen dengan panjang fragmen1.063bp menggunakanprimer PAT TF dan PAT 2.3. Fragmen sekitar 750 bp hasil amplifikasi primer PAT D dan PAT DRdiyakini sebagai genPAT (parsial) dengan konsistensi yang lebih baik.4. Melalui kloning dan transformasi dalam E. coli DH5a.,telah dihasilkanplasmid rekombinan yang membawa fragmen DNA hasil isolasi.5. Konfirmasi dan verifikasi diperlukan dalam penentuan hasil isolasigen dan sekuen DNA (gen target).Saran1. Perlu penelitian lanjutan guna mendapatkan gen PAT lengkap danfa mily g en e penyandi sifat yang berasosiasi dengan kualitas minyakkelapa sawit.2. Sebelum direkayasa, gen PATdapat diuji terlebih dahulu pada bakteriapakah ada g en e p ro du ct berupa asam palmitat.3. Perlu analisis lebih jauh strategi atau metode rekayasa genetika yangtepat sebagai upaya menghambat ekspresi gen PAT.4. Perlu kajian komprehensif dan mendalamkaitan gen yang direkayasaterhadap ekspresi tanaman secara utuh.

5/7/2018 1

7/7

~vo El.UfiVvEl.JJVv, ~;;T \-LJ, lJ.- .nIL.r LVVV

DAFTAR PUSTAKAAnonim, 1999. Studi tentang Perkebunan dan Pem asaran M inyak Kelapa Saw it Indone-sia. PI International Contact Business System Inc. Jakarta.Anonim, 2002a. QIAqu icJ