02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan...

58

Transcript of 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan...

Page 1: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias
Page 2: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias
Page 3: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

PUSAT KARANTINABADAN KARANTINA IKANDAN KEAMANAN HASIL PERIKANANKEMENTERIAN KELAUTAN DAN PERIKANAN

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada

PUSAT KARANTINA DAN KEAMANAN HAYATI IKANBADAN KARANTINA IKAN, PENGENDALIAN MUTUDAN KEAMANAN HASIL PERIKANANKEMENTERIAN KELAUTAN DAN PERIKANAN

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus padaIkan Hias Air Tawar dan Laut

2016Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada

Air Tawar dan Laut

Page 4: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

PETUNJUK TEKNISSurveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Air Tawar dan Laut

Tim Penyusun:

Prof. Dr. Ir Slamet Budi Prayitno, M.Sc

Prof. Bambang Sumiarto

Dr. Arief Taslihan

Heri Yuwono, S.Pi, M.P

Ir. Asep Dadang Koswara, M.Si

Ir. Muhammad Ridwan, M.P

M. Ghufron Purnama, M.Si

Iwan Supriadi, S.P, M.P

Usman Affandi, S.Pi

Inda Wahyuni, S.St.Pi, M.Si

Nani Sri Rahayu, A.Pi

Sri Supriyanti, S.Pi

Bazar Ristiyawan, S.Pi

Page 5: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut i

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT, atas berkat dan rahmat-

Nya Petunjuk Teknis “Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan

Laut” dapat diselesaikan dengan baik.

Seiring pesatnya produksi komoditas perikanan dan meningkatnya lalu-

lintas perdagangan ikan hias antar negara dewasa ini telah memunculkan

kekhawatiran akan penyebaran penyakit eksotik lintas Negara. Salah yang

menjadi satu isu penting saat ini adalah terkait penyebaran Megalocytivirus.

Oleh karena itu deteksi dini untuk mengetahui adanya infeksi Megalocytivirus

pada komoditas ikan di Indonesia sangat diperlukan untuk mengurangi

dampak kerugian yang ditimbulkan. Ditambah lagi adanya potensi penularan

virus ini, maka diperlukan upaya pencegahan dan kewaspadaan terhadap

meluasnya penyebaran.

Untuk menjawab kebutuhan tersebut, Pusat Karantina dan Keamanan

Hayati Ikan telah menyusun petunjuk teknis pelaksanaan surveilan

Megalocytivirus, dengan harapan petunjuk teknis ini dapat menjadi acuan

bagi tim surveilan agar pelaksanaan kegiatan surveilan dapat lebih terukur,

terarah, dan hasilnya dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah.

Bersama ini tak lupa kami ucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya

kepada :

1. Prof. Dr. Ir Slamet Budi Prayitno, M.Sc; Prof. Bambang Sumiarto; Dr. Arief

Taslihan; serta Ir. Asep Dadang Koswara, M.Si selaku narasumber dalam

penyusunan petunjuk teknis ini;

2. Semua pihak yang terlibat dalam penyusunan petunjuk teknis ini yang

tidak dapat kami sebutkan satu persatu.

Kami menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam

penyusunannya sehingga saran dan masukkan yang membangun sangat kami

harapkan demi penyempurnaan di masa yang akan datang.

Jakarta, Januari 2016Kepala Pusat Karantina danKeamanan Hayati Ikan

Riza Priyatna

Page 6: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut ii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ...................................................................................................... i

DAFTAR ISI..................................................................................................................... ii

BAB I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang ................................................................................................ 1

1.2. Tujuan................................................................................................................ 3

1.3. Dasar Hukum .................................................................................................. 3

BAB II. KAJIAN PUSTAKA

2.1. Megalocytivirus ............................................................................................... 5

2.2. Ethiology Megalocytivirus .............................................................................. 7

2.3. Pathogenitas dan Epidemiologi Megalocytivirus ..................................... 8

2.4. Kondisi Terkini Megalocytivirus ..................................................................... 9

2.5. Surveilan .......................................................................................................... 10

2.6. Aspek Legalitas dalam Surveilan di Indonesia .......................................... 10

2.7. Unsur Surveilan ................................................................................................ 11

BAB III. METODELOGI SURVEILAN MEGALOCYTIVIRUS

3.1. Disain Program Surveilan untuk Penentuan Area Bebas Pathogen

Tertentu..............................................................................................................12

3.2. Infrastruktur Surveilan.......................................................................................12

3.2.1. Laboratorium.........................................................................................12

3.2.2. Metode Uji..............................................................................................13

3.2.3. Petugas Pengambil Contoh Uji...........................................................13

3.2.4. Alur Data ................................................................................................13

3.3. Disain Surveilan.................................................................................................14

3.3.1. Alat dan Bahan.....................................................................................14

Page 7: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut iii

3.3.2. Penentuan Metoda Diagnosis, Sensistifitas dan Spesifitas

Pengujian .............................................................................................15

3.3.3. Lokasi Pengambilan Contoh Uji........................................................15

3.3.4. Penentuan Jumlah Contoh Uji..........................................................15

3.3.5. Metode Pengambilan Contoh Uji ....................................................16

BAB IV. EVALUASI DAN PELAPORAN SURVEILAN MEGALOCITYVIRUS

4.1. Format Pelaporan............................................................................................19

4.2. Mekanisme Pelaporan....................................................................................19

4.3. Waktu Pelaporan.............................................................................................20

BAB V. PENUTUP

DAFTAR PUSTAKA

DAFTAR GAMBAR

DAFTAR TABEL

DAFTAR LAMPIRAN

Page 8: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut iv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Diagram Skematik Penampang Partikel Megalocytivirus ......... 6

Gambar 2. Inclusion Body-bearing Cells (IBCs) dari Dwarf Gourami

yang Terinfeksi Megalocytivirus ...................................................... 7

Gambar 3. Alur Informasi dari Farm ke Pusat Data ......................................... 14

Gambar 4. Diagram Sistem Pooling Contoh Uji untuk qPCR .......................... 18

Gambar 5. Pencatanan dan Pelabelan .......................................................... 25

Gambar 6. Kurva Standar ................................................................................... 34

Gambar 7. Kurva Pengujian Sampel ................................................................. 36

Page 9: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut v

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Komposisi Kaktail untuk qPCR .............................................................. 32

Tabel 2. Program Amplifikasi ............................................................................... 33

Tabel 3. Keterangan Gambar Kurva Standar Hasil Amplifikasi Real Time ... 35

Tabel 4. Keterangan Gambar Pengujian Hasil Amplifikasi Real Time ........... 37

Tabel 5. Pencatanan dan Pelabelan ................................................................ 25

Page 10: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut vi

Petunjuk Teknis

Surveilan Megalocytivirus

pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut

Diterbitkan Oleh:

Pusat Karantina dan Keamanan Hayati Ikan

Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan

Kementerian Kelautan dan Perikanan

Jalan Medan Merdeka Timur No. 16

Gedung Mina Bahari II Lantai 6 Jakarta Pusat 10110

Telp. (021) 3513277, Fax. (021) 3513275

2016

Page 11: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Peningkatan produksi komoditas perikanan dewasa ini sangat pesat,

terlihat dengan grafik peningkatan produksi yang ditampilkan oleh negara

produsen. Dibalik itu, kekhawatiran akan perkembangan jenis penyakit baru

sangat menghawatirkan, yang dapat menjadi masalah besar bagi negara

yang terkena wabah. Tercatat Koi Herpes Virus, Early Mortality Syndrome

dengan cepat menyebar tanpa batas wilayah negara. Penyebaran

penyakit eksotik lintas negara antara lain adalah disebabkan peningkatan

lalu lintas ikan global. Muncul dan berkembangnya penyakit baru dan

menjadi wabah menakutkan menyebabkan kesadaran bagi setiap negara

untuk melakukan perlindungan terhadap negaranya agar tidak tertular

penyakit eksotik melalui prosedur sanitary and phytosanitary (OIE, Aquatic

Code, 2014).

Pada perdagangan ikan hias antar negara kekhawatiran akan

masuknya jenis virus baru adalah menjadi isu yang penting. Salah satu

permasalahan terkait dengan perdagangan ikan hias adalah dikhawatirkan

membawa Megalocytivirus, yang bagi negara tertentu merupakan isolat

baru yang dapat mengancam perikanan di negara pengimpor.

Perdagangan internasional ikan hias hidup merupakan rute utama masuknya

Megalocytivirus ke area geografis baru (Whitington Chong, 2007 dalam

Rimmer et al., 2012.

Megalocytivirus termasuk famili Iridoviridae yang banyak menyerang

organisme perairan baik ikan maupun amphibi. Laporan Sung et al. (2010)

infeksi Megalocytvirus pada ornamental fish menyebabkan kematian antara

30 sampai 100%. Secara patologi anatomi ikan yang terinfeksi

Megalocytivirus menunjukkan gejala anemia, radang dan pembengkakan

pada limpa dan ginjal, pada sel-sel yang diserang terbentuk inclusion body-

bearing cell (IBC) serta mengalami nekrosis jaringan (Mahardika et al., 2008).

Page 12: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 2

Di Indonesia, infeksi Megalocytivirus telah terdeteksi pada jenis ikan air

tawar dan air laut (Abidin, 2013). Jenis ikan air tawar di Indonesia yang

dilaporkan terinfeksi adalah ikan gurami hias, sedangkan pada ikan air laut

yaitu ikan kerapu bebek, kerapu lumpur, kerapu macan, serta ikan

capungan. Pemerintah Indonesia melalui Kementerian Kelautan dan

Perikanan (KKP) telah menetapkan Megalocytivirus sebagai salah satu

kelompok Hama dan Penyakit Ikan Karantina (HPIK) golongan I dengan

daerah penyebaran Megalocytivirus di Indonesia saat ini adalah Sumatera

Utara, Sumatera Barat, Kepulauan Riau, Lampung dan Bali (Anonim, 2015).

Oleh karena itu deteksi dini untuk mengetahui adanya infeksi

Megalocytivirus pada komoditas ikan sangat diperlukan untuk mengurangi

dampak kerugian yang disebabkan karena serangan Megalocytivirus.

Ditambah lagi adanya potensi penularan virus ini, sehingga pemeriksaan

dan pengawasan kesehatan ikan perlu dilakukan untuk mencegah

meluasnya penyebaran. Selain itu, terdapat Biosecurity Advice 2014/11

tentang Quarantine Policy For Freshwater Ornamental Finfish From Approved

Countries yang diterbitkan oleh Department of Agriculture Australia pada

tanggal 8 September 2014 menyebutkan ketentuan karantina terkait bebas

Megalocytivirus untuk beberapa jenis ikan hias (Gouramies, Poeciliids, Betas,

Paradise Fish, dan Cichlids) yang akan diimpor oleh Australia dari negara-

negara yang telah disetujui untuk melakukan ekspor ke Australia, termasuk

Indonesia.

Sebagai langkah lanjut, Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu

dan Keamanan Hasil Perikanan bekerjasama dengan Direktorat Kesehatan

Ikan dan Lingkungan dan Badan Penelitian dan Pengembangan Kelautan

dan Perikanan akan melaksanakan active targetted surveillance yang

dilakukan di beberapa wilayah untuk membuktikan ada tidaknya

Megalocytivirus dan gejala klinis yang mencurigakan pada populasi sumber

ikan selama kurun waktu minimal 2 (dua) tahun.

Page 13: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 3

1.2. Tujuan

Petunjuk teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias ini disusun

sebagai acuan bagi tim surveilan dalam:

- Mendeteksi, menentukan prevalensi dan faktor risiko Megalocytivirus

pada ikan hias air tawar di wilayah sentra budidaya ikan hias Jawa

Barat, DKI Jakarta, Sumatera Utara.

- Mendeteksi dan menentukan prevalensi dan faktor risiko

Megalocytivirus pada ikan hias air laut di wilayah sentra budidaya ikan

hias Sulawesi Utara, Sulawesi Tengah, Sulawesi Tenggara, Bali.

- Menentukan dan menetapkan area bebas infeksi Megalocytivirus

pada farm ikan hias di sentra budidaya ikan hias Jawa Barat, DKI

Jakarta, Sumatera Utara, Sulawesi Utara, Sulawesi Tengah, Sulawesi

Tenggara, Bali.

1.3. Dasar Hukum

1. Undang-Undang Nomor 16 Tahun 1992 tentang Karantina Hewan,

Ikan, dan Tumbuhan;

2. Undang-Undang Nomor 7 Tahun 1994 tentang Pengesahan

Agreement Establishing The World Trade Organization khususnya

tentang SPS Agreement (Sanitary and Phytosanitary).

3. Undang-Undang Nomor 31 tahun 2004 tentang Perikanan,

sebagaimana diubah dengan Undang-Undang Nomor 45 tahun

2009;

4. Peraturan Pemerintah Nomor 15 tahun 2002 tentang Karantina

Ikan;

5. Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan Nomor

PER.05/MEN/2005 tentang Tindakan Karantina untuk Pengeluaran

Media Pembawa Hama dan Penyakit Ikan Karantina;

6. Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan Nomor

PER.13/MEN/2007 tentang Sistem Pemantauan Hama dan Penyakit

ikan Karantina

Page 14: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 4

7. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan Nomor: 80/KEPMEN-

KP/2015 tentang Penetapan Hama dan Penyakit Ikan Karantina,

Golongan, Jenis Media Pembawa dan Sebarannya;

8. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan Nomor: 81/KEPMEN-

KP/2015 tentang Penetapan Area yang Tidak Bebas Penyakit Ikan

Karantina, Golongan dan Media Pembawanya di Dalam Wilayah

Negara Republik Indonesia.

Page 15: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 5

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

4. 1. Megalocytivirus

Megalocytivirus merupakan salah satu genus dalam famili iridoviridae.

Famili Iridoviridae, beranggotakan lima genera, yaitu Irridovirus,

Chloriridovirus, Ranavirus, Lymphocystivirus, dan Megalocytivirus, dan semua

sudah disekuen lengkap (She et al., 2010, Wou et al., 2013). Megalocytivirus

adalah genus yang terakhir ditambahkan ke dalam family ini (Chinchar , et

al., 2005).

Menurut Chao et al. (2004), genus Megalocytivirus awalnya diusulkan

pada tahun 2003 yang kemudian diterima oleh International Committee on

Taksonomi Virus (ICTV) dan ditambahkan dalam keluarga Iridoviridae.

Taksonomi Megalocytivirus menurut Andrew et al, 2012 dalam International

Committee on Taksonomi Virus (ICTV) adalah sebagai berikut:

Filum : Vira

Sub filum : Deoxyvira (DNA viruses).

Kelas : Deoxycubica (cubical symmetry)

Ordo : Haploviridae (no envelope)

Family : Iridoviridae (812 capsomeres)

Genus : Megalocytivirus

Spesies : Infectious spleen and kidney necrosis virus

Megalocytivirus memiliki satu spesies yang terdaftar pada International

Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), yaitu Infectious Spleen and

Kidney Necrosis Virus (ISKNV). Beberapa varian virus yang termasuk kedalam

genus Megalocytivirus tetapi belum dapat dimasukan dalam spesies antara

lain: Red seabream iridovirus (RSIV), Sea bass iridovirus (SBIV), African

lampeye iridovirus (ALIV), Grouper sleepy disease iridovirus (GSDIV), Dwarf

Page 16: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 6

gourami iridovirus (DGIV), Taiwan grouper iridovirus (TGIV), Rock bream

iridovirus (RBIV), Orange-spotted grouper iridovirus (OSGIV), Turbot iridovirus

(TBIV), Spotted knife jaw iridovirus (SKIV) (Andrew et al, 2012).

Subramaniam et al., 2013 membagi Megalocytivirus berdasarkan gen

major capsid protein (MCP) menjadi 3 genotipe, yaitu; Genotipe I (Infectious

spleen and kidney necrosis virus, Dwarf gourami iridovirus, African lampeye

iridovirus, dan Murray cod iridovirus) meliputi isolate dari berbagai spesies

ikan laut di Jepang, Korea, Cina, dan Thailand. Genotipe II (Red Sea bream

iridovirus, Grouper sleppy disease iridovirusdan Rock bream iridovirus) terdiri

atas isolate dari spesies ikan air tawar di negara-negara Asia Tenggara

termasuk China, Indonesia, dan Malaysia, dan ikan laut yang ditangkap di

Laut Cina Selatan. Genotipe III (Turbot reddish body iridovirus dan Korean

flounder iridovirus) terutama terdiri dari isolate dari spesies flatfish di Korea

dan Cina.

Virus anggota Irridovirus adalah virus kategori besar, bentuk virion

icosahedral, double-stranded DNA (dsDNA), terdiri dari filament

nucleoprotein dikelilingi oleh membran lipid yang mengandung protein trans

membran yang belum diketahui fungsinya (Gambar 1).

Gambar 1. Diagram skematik penampang dari partikel Megalocytivirus, menunjukkan

capsomers, transmembran proteins dalam lapisan lipid, dan inti nucleoprotein

(Andrew et al, 2012).

Page 17: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 7

4. 2. Ethiologi Megalocytivirus

Infeksi Megalocytivirus dicirikan dengan formasi sel-sel membesar dan

sel-sel nekrotik. Di bawah electron mikroskopi, sel-sel membesar merupakan

IBCs (inclusion body bearing cell) yang kemungkinan merupakan sel

makrofage yang terinfeksi virus, dan sel tersebut membesar seiring

perkembangan badan inklusi (inclusion body) yang secara halus dibatasi

oleh membrane halus dengan inti dan sitoplasma sel inangnya (Chinchar et

al., 2005). Sel-sel membesar pertama ditemukan di jaringan limpa dan ginjal,

yang selanjutnya sel-sel tersebut menyebar ke beberapa organ dalam

seperti hati, jantung, lambung, usus dan ginjal belakang melalui peredaran

darah (Chao et al., 2004; Mastuti dan Mahardika, 2010).

Mahardika et al. (2004a dan 2009a) melaporkan bahwa kumpulan sel-

sel membesar terbentuk akibat reaksi dari protein antivirus yang terdapat

dalam sistem pertahanan tubuh ikan secara alami. Akan tetapi kapan mulai

terbentuknya sel-sel membesar tersebut pada jaringan limpa dan ginjal

(organ target) belum dilaporkan. Pada Mikroskop electron terlihat inclusi

body yang mengandung banyak virus di dalamnya (gambar 2).

Keterangan :

Detail virus. Virus berbentuk hexagonal

dan diameter yang berukuran 140-150

nm.

Gambar 2. Mikroskop Elektron,

inclusion body-bearing cells

(IBCs) dari Dwarf Gourami yang

Terinfeksi Megalocytivirus.

(Sumber : Sudthongkonget al., 2002a).

Page 18: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 8

Virus dari genus Megalocytivirus menginfeksi sel-sel target melalui

proses endocytosis (reseptor-mediated endocytosis). DNA virus masuk ke

dalam inti sel dan berkembangbiak (perkembangbiakan virus tahap

pertama). DNA virus selanjutnya keluar dari inti sel ke dalam sitoplasma

melalui membran inti yang rusak atau pecah (rupture) dan berkembangbiak

di dalam VAS (virtual assembly site) (perkembangbiakan virus tahap kedua).

Di dalam sitoplasma sel tersebut, DNA virus akan membentuk partikel virus

(viral-concatemer) (Chinchar et al., 2005; Chao et al., 2004; Mahardika dan

Miyazaki, 2008).

4. 3. Pathogenitas dan Epidemiologi Megalocytivirus

Virus anggota Irridovirus dapat menginfeksi invertebrata dan

vertebrata poikilothermal, termasuk hewan yang dapat terinfeksi adalah

insekta, ikan, amfibia dan Reptil (She et al., 2010). Genus Megalocytivirus

diketahui sebagai penyebab penyakit yang signifikan, mortalitas dan

kerugian ekonomi pada ikan, khususnya ikan hias (Rimmer et al., 2012b).

Megalocytivirus adalah virus dsDNA yang menyebabkan infeksi sistemik

pada ikan budidaya air tawar maupun ikan budidaya air laut. Wabah

Megalocytivirus bersifat epizootic yang dapat menyebabkan kematian

massal ikan budidaya dalam waktu yang relative singkat (1-2 minggu dari

awal kejadian) sehingga menyebabkan kerugian ekonomi yang cukup besar

bagi pembudidaya. Secara patologi anatomi, ikan yang terinfeksi

Megalocytivirus menunjukkan gejala anemia, radang dan pembengkakan

pada limpa dan ginjal, pada sel-sel yang diserang terbentuk inclusion body-

bearing cell (IBC) serta mengalami nekrosis jaringan (Mahardika et al., 2008).

Di Indonesia, infeksi iridovirus pertama kali dilaporkan menginfeksi dan

menyebabkan kematian massal pada ikan kerapu lumpur Epinephelus

tauvina di Sumatera (Owen, 1993; Koesharyani et al., 2001). Selanjutnya,

iridovirus dilaporkan dapat menginfeksi ikan kerapu lumpur Epinephelus

coioides dan E. bleekery (Mahardika et al., 2001; Koeshariyani et al., 2001),

induk kerapu lumpur (Mahardika et al., 2003) kerapu macan E. fuscoguttatus

Page 19: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 9

dan kerapu batik E. polyphekadion (Mahardika et al., 2004b), kerapu sunu

Plectropomus indicus (Mahardika et al., 2009b), dan kakap putih Lates

calcarifer (Mahardika dan Mastuti, 2010).

Infeksi iridovirus pada ikan kerapu dikenal dengan sebutan grouper

sleepy disease iridovirus (GSDIV) karena gejala klinis yang ditimbulkan yaitu

ikan tidur dengan satu sisi tubuh di dasar bak (Sudthongkong et al., 2002;

Mahardika et al., 2004a). Megalocytivirus juga pernah dilaporkan

menginfeksi ikan African Lampeye dan Dwarf Gourami yang dipelihara di

Sumatera dan diekspor ke Jepang melalui Singapore (Sudthongkong et al.,

2002).

4. 4. Kondisi Terkini Megalocytivirus

Epizootic Haematopoetic Necrosis Virus (EHNV), famili Iridoviridae dan

genus Ranavirus, Bohle iridovirus dan lymphocystis virus adalah tiga genera

Irridovirus yang endemik di Australia (Rimmer et al., 2012a). Karantina ikan

Australia melaporkan 5 species ikan yang mengalami kematian lebih dari

25% pada pasca karantina dan diketahui memiliki gejala Megalocytivirus-like

inclusion bodies pada pengamatan histopatologi serta positif pada

pengamatan PCR. Ikan dengan gejala tersebut diimpor dari Singapora,

Malaysia dan Sri Lanka. Sebanyak 97 dari 111 ikan dari bak terinfeksi telah

diuji positiv Megalocytivirus melalui pemeriksaaan dengan PCR (Tidaklan et

al., 2014).

Teknik diagnosis berbasis molekuler telah dikembangkan untuk

keperluan deteksi Megalocytivirus. Salah satunya adalah secara Polymerase

Chain Reaction (PCR), karena dengan teknik ini diagnosis dapat dilakukan

dengan cepat terutama untuk perdagangan ikan hias lintas negara (Rimmer

et al., 2012). Aplikasi PCR sebagai perangkat deteksi Megalocytivirus dipilih

karena PCR mempunyai spesifisitas dan sensitifitas yang tinggi. Primer telah

dibuat untuk PCR didisain untuk deteksi daerah target gen dari berbagai

genotipe virus sehingga mampu deteksi baik ISKNV-like dan RSIV-like

Megalocytivirus genotypes (Rimmer et al., 2012).

Page 20: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 10

4. 5. Surveilan

Surveilan adalah kegiatan koleksi data yang dilakukan secara

sistematik, penyusunan dan analisis terhadap informasi terkait dengan

kesehatan hewan, selanjutnya melakukan diseminasi terhadap hasil informasi

yang diperoleh kepada pihak yang memerlukannya agar dapat dilakukan

tindakan pengendalian (Corsin et al., 2009). Surveilan merupakan bagian

dari kajian epidemiologi yang bertujuan untuk mendapatkan informasi

mengenai penyakit di suatu wilayah, termasuk di dalamnya aras, distribusi

dan faktor penyebab. Target kegiatan tersebut adalah melakukan

pencegahan, pengendalian, pengobatan dan eradikasi sehingga tidak

menimbulkan kerugian yang lebih besar.

Tujuan dilakukan surveilan adalah (1) membuktikan bahwa penyakit

tertentu tidak terdapat disuatu area, (2) keperluan untuk melakukan

notifikasi, (3) menentukan keberadaan atau disitribusi penyakit endemik

termasuk perubahan dalam hal insidensi dan prevalensi. Laporan surveilan

sangat diperlukan untuk keperluan pengendalian penyakit maupun sebagai

bahan informasi secara internasional bagi negara partner dagang.

Berdasarkan cara memperoleh data, surveilan dapat dibedakan

menjadi surveilan pasif dan aktif. Survellan secara pasif melakukan

pengumpulan data dilakukan secara non-random, seperti berdasarkan

laporan pembudidaya, laboratorium yang menerima sampel untuk

dilakukan diagnosis. Surveilan aktif memperoleh data melalui cara terstruktur,

pengambilan sampel dilakukan secara random maupun secar sistematik.

4. 6. Aspek Legalitas Pelaksanaan Surveilan di Indonesia

Kegiatan surveilan adalah mengacu pada Peraturan Menteri Kelautan

dan Perikanan Nomor Per.13/MEN/2007 tentang Sistem Pemantauan Hama

dan Penyakit Ikan Karantina, yang menjadi payung hukum bagi

pelaksanaan kegiatan surveilan dan monitoring penyakit ikan. Berdasarkan

payung hukum tersebut kemudian dapat dikembangkan peraturan

peraturan yang menjadi produk hukum turunannya, antara lain adalah

Page 21: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 11

pelaksanaan kegiatan surveilan, penanganan masalah darurat terkait

munculnya wabah, hingga pemberian bantuan apabila terjadi wabah

kepada pembudidaya.

4. 7. Unsur Surveilan

Beberapa istilah dipergunakan terkait dengan pelaksanaan surveillan,

yaitu populasi, unit epidemiologi dan klastering. Surveilan harusnya dilakukan

dengan mempertimbangkan seluruh individu dalam populasi yang peka

terhadap infeksi patogen target dari suatu negara, zona atau kompartemen.

Estimasi Population At Risk total setiap spesies yang peka terhadap suatu jenis

patogen sangat diperlukan.

Kegiatan surveillan harus menetapkan unit epidemiologi, termasuk

didalamnya adalah karier, reservoir, vektor, status kekebalan, status usia dan

resistensi genetik, sex dll. Unit epidemiologi tersebut perlu dipertimbangkan

dan dimasukkan dalam laporan.

Jarang terjadi suatu jenis penyakit tersebar secara merata. Pada

umumnya, penyebaran penyakit terjadi di lingkup klaster, terbatas pada

suatu area tertentu (farm, kompartemen atau zona) yang dibatasi oleh aliran

air, waktu dan kelompok umur. Informasi klaster ini sangat penting bagi

interpretasi data yang diperoleh.

Page 22: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 12

BAB III

METODELOGI SURVEILAN MEGALOCYTIVIRUS

3.1. Disain Program Surveilan untuk Penentuan Area Bebas Patogen

Tertentu

Penghitungan jumlah sampel untuk program surveillan dibuat

berdasarkan hipotesis nol, bahwa prevalensi patogen ada di area yang

disurveilan pada batas serendah mungkin, umumnya ditentukan 2%. Dasar

penentuan hipotesis nol tersebut adalah sebagai pertimbangkan bahwa,

hampir tidak mungkin area 100% bebas dari penyakit.

3.2. Infrasutruktur Surveilan

3.2. 1. Laboratorium

Ada dua tipe laboratorium terkait dengan program surveilan, yaitu

laboratorium rujukan (reference laboratory) dan laboratorium uji (testing

laboratory). Penentuan laboratorium adalah berdasarkan fungsi

laboratorium terkait dengan kegiatan diagnosis.

Laboratorium rujukan adalah laboratorium yang ditunjuk sebagai

laboratorium tempat melakukan kegiatan validasi metode uji, melakukan

pelatihan, dan menjalankan kerjasamanya dengan laboratorium rujukan

yang telah ditunjuk oleh OIE. Laboratorium rujukan harus berstatus

terakreditasi ISO 17025 oleh KAN atau badan akreditasi internasional lainnya.

Laboratorium uji adalah laboratorium yang bertugas untuk melakukan

pengujian sampel. Laboratorium uji berada di bawah kendali laboratorium

rujukan dalam pemilihan metode uji, dan pelatihan SDM oleh laboratorium

rujukan. Penetapan laboratorium rujukan dan laboratorium uji untuk kegiatan

surveilan Megalocytivirus pada ikan hias ini lebih jauh ditetapkan dengan

Keputusan Kepala Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan

Keamanan Hasil Perikanan.

Page 23: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 13

3.2. 2. Metode Uji

Metode uji untuk pengujian Megalocytivirus adalah Real-Time PCR

(qPCR, sesuai permintaan Australia) dan PCR Konvensional Nested PCR

(sesuai dengan metode standar OIE). Metode uji sudah dilakukan validasi

dan koordinasi laboratorium rujukan.

3.2. 3. Petugas Pengambil Contoh Uji (PPC)

Pengambilan contoh uji dilakukan oleh petugas pengambil contoh uji

(PPC). Petugas Pengambil harus petugas yang terlatih, dibuktikan dengan

sertifikat. Tenaga PPC harus sudah dilakukan pelatihan dengan materi,

pengenalan penyakit terkait dengan Megalocytivirus, termasuk didalamnya

gejala klinis penyakit, dasar populasi, pola penyebaran penyakit, metode

pengambilan contoh, Teknik pembedahan dan preservasi, serta pengiriman

sampel.

3.2. 4. Alur Data

Alur data, dimulai dari Petugas Pengambilan Contoh Uji. Setelah

mengambil contoh uji berupa ikan dan data kuesioner, selanjutnya dikirim ke

Laboratorium UPT KIPM atau Laboratorium UPT DJPB yang ditunjuk

berdasarkan SK Kepala Badan KIPM, untuk selanjutnya dilakukan

pemeriksaan terhadap contoh uji. Data hasil analisa contoh uji beserta data

kuesioner selanjutnya dikirim ke Pusat Data (Pusat Karantina dan Keamanan

Hayati Ikan) untuk dilakukan verifikasi, penggolongan (collation), selanjutnya

setelah semua data terkumpul dilakukan analisa untuk menentukan

prevalensi dan faktor risiko.

Analisa data menggunakan perangkat lunak (software) seperti

Statistix, atau GenStat atau SPS. Langkah terakhir adalah pelaporan dan

diseminasi hasil. Keluaran (output) berupa prevalensi, faktor risiko, rasio ganjil

(Odd Ratio, OR), dll.

Page 24: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 14

Gambar 3. Alur Informasi dari Farm ke Pusat Data

3.3. Disain Surveilan

3.3.1. Alat dan Bahan

Peralatan yang dipergunakan dalam kegiatan surveilan adalah

berupa alat pemeriksaan kualitas air, peralatan pengambilan sampel

berupa jala dan seser, botol sampel volume 200 ml. Peralatan untuk

pembedahan dan preservasi sampel berupa dissecting set serta peralatan

pengujian di laboratorium.

Bahan yang dipergunakan dalam penelitian adalah bahan preservasi

sampel berupa alkohol 80%, preservative Bouin untuk tujuan pembuatan

preparat histologi.

Pusat Karantinadan Keamanan

Hayati Ikan

DirektoratKesehatan Ikandan Lingkungan

UPT KIPM UPT DJPB

PPC PPC

Farm Farm

Page 25: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 15

3.3.2. Penentuan Metode Diagnosis, Sensitifitas dan Spesifisitas Pengujian

Metode diagnosis yang dipilih untuk ikan hias air tawar menggunakan

pengujian dengan metode qPCR dengan tingkat sensitifitas metode adalah

99%, dan spesifisitas uji 99%, sedangkan untuk ikan hias air laut menggunakan

metode konvensional PCR double step nested, dengan sensitivitas 95% dan

spesifisitas 99%.

3.3.3. Lokasi Pengambilan Contoh Uji

Penetuan lokasi pengambilan contoh uji dalam kegiatan surveilan

Megalocytivirus didasarkan pada wilayah asal ikan-ikan budidaya yang

berpotensi sebagai inang Megalocytivirus. Lokasi tersebut menjadi titik

pengambilan contoh uji dikarenakan, mayoritas eksportir mengambil ikan

dari wilayah tersebut.

Adapun lokasi yang ditetapkan untuk Surveilan Ikan Hias Air Tawar,

adalah: Bogor, Bekasi, Bandung, Depok dan Medan (Sumatera Utara),

sedangkan lokasi yang ditetapkan untuk Surveilan Ikan Hias Air Laut adalah

Luwuk Banggai (Sulawesi Tenggara).

3.3.4. Penentuan Jumlah Contoh Uji

Metode yang dipilih untuk pengambilan contoh uji adalah two stage

systematic sampling. Pertama memilih farm, kemudian memilih

tambak/kolam. Unit epidemiologi adalah tambak/kolam sebagai unit

terkecil.

Jumlah sampel yang akan diambil ditentukan berdasarkan asumsi

prevalensi 5%, tingkat kepercayaan 95%, sensitifitas uji 99% dan spesifisitas uji

95%. Selanjutnya dengan menggunakan program SurveiToolbox, maka

jumlah sampel yang harus diambil sebanyak 129 sampel.

Jumlah sampel untuk ikan hias air laut, menggunakan konvensional

PCR, double step nested, dengan asumsi prevalensi 5%, tingkat kepercayaan

95%, sensitifitas uji 95% spesifisitas uji 99%, didapatkan jumlah sampel dari

Page 26: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 16

populasi ikan hias laut dari Banggai sebanyak 134 ekor. Ikan sejumlah 134

ekor ikan diambil dari keramba yang memasok ikan, dengan proporsi ikan

ditentukan berdasarkan jumlah ikan setiap keramba.

Contoh 1 (Pengujian dengan menggunakan metode qPCR):

Di Kab. Bogor terdapat 20 farm ikan hias air tawar. Kabupaten Bogor

dianggap sebagai satu kompartemen. Dari 20 farm disampling secara acak

sebanyak 30% dari jumlah farm (6 farm). Dengan asumsi prevalensi 5%,

tingkat kepercayaan 95% maka jumlah sampel yang harus diambil di

Kabupaten Bogor sebanyak 129 ekor. Maka jumlah sampel setiap farm yang

diambil sebanyak 129 ekor/6 farm = 22 ekor/farm

Jumlah sampel dalam satu kali surveilan sebanyak = 129 ekor

Jumlah sampel dalam 1 tahun (tujuh kali surveilan) sebanyak 129 x 7 = 903

ekor.

Contoh 2 (Pengujian dengan menggunakan metode konvensional PCR,

double step nested):

Di Kab. Luwuk Banggai terdapat 50 farm ikan hias air laut (Banggai Cardinal).

Kabupaten Luwuk Banggai dianggap sebagai satu kompartemen. Dari 50

farm disampling secara acak sebanyak 30% dari jumlah farm (15 farm).

Dengan asumsi prevalensi 5%, tingkat kepercayaan 95% maka jumlah

sampel yang harus diambil di Kabupaten Luwuk Banggai sebanyak 134 ekor.

Maka jumlah sampel setiap farm yang diambil sebanyak 134 ekor/15 farm =

9 ekor/farm

Jumlah sampel dalam satu kali surveilan sebanyak = 134 ekor

Jumlah sampel dalam 1 tahun (tujuh kali surveilan) sebanyak 134 x 7 = 938

ekor.

3.3.5. Metode Pengambilan Contoh Uji

Surveilan Ikan Hias Air Tawar

Surveilan ikan hias tawar, sebagai unit sampel adalah kolam, dengan

ikan adalah sub-sampel. Apabila dari hasil pemeriksaan ditemukan bahwa

Page 27: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 17

apabila ikan yang diambil dari kolam positif terinfeksi Megalocytivirus, maka

kolam dinyatakan positif. Metode pengambilan sampel adalah secara

Simple Random Sampling atau menggunakan Systematic Random Sampling.

Pertama dilakukan penomoran terhadap semua farm di daerah surveilan.

Pengambilan sampel dengan Simple Random Sampling

menggunakan bantuan kartu random, kemudian dipilih sampel dari total

farm yang teridentifikasi. Pengambilan sampel berdasarkan Systematic

Random Sampling dengan cara, pertama ditentukan interval yaitu total farm

yang diidentifikasi dibagi dengan total sampel yang akan diambil,

selanjutnya ditentukan pengambilan sampel berdasarkan interval.

Surveilan Ikan Hias Air Laut

Surveilan ikan hias air laut, sebagai unit sampel adalah karamba

tancap, dengan ikan adalah sub-sampel. Apabila dari hasil pemeriksaan

ditemukan bahwa apabila ikan yang diambil dari keramba positif terinfeksi

Megalocytivirus, maka dinyatakan positif. Metode pengambilan sampel

yang digunakan adalah secara Simple Random Sampling atau

menggunakan Systematic Random Sampling. Pertama dilakukan terhadap

semua keramba di daerah surveilan. Pengambilan sampel dengan Simple

Random Sampling menggunakan bantuan kartu random, kemudian dipilih

sampel dari total farm yang teridentifikasi. Pengambilan sampel berdasarkan

Systematic Random Sampling dengan cara, pertama ditentukan interval

yaitu total farm yang diidentifikasi dibagi dengan total sampel yang akan

diambil, selanjutnya ditentukan pengambilan sampel berdasarkan interval.

Ikan diambil dari kolam, bak, akuarium maupun karamba dipilih

secara purposive, berdasarkan gejala klinis spesifik yang mengarah pada

gejala infeksi megalocytivirus. Ikan yang telah menunjukkan gejala kemudian

diambil dan dilakukan prosedur pengambilan dan preservasi.

Prosedur pooling sampel dapat dilakukan berbasis kolam, dengan

cara ikan dari tiap kolam dilakukan ekstraksi DNA, selanjutnya dibuat pool

Page 28: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 18

untuk kemudian dilakukan pemeriksanaan qPCR. Pooling untuk farm

dilakukan seperti halnya pooling ikan perkolam, dengan cara ikan dari setiap

kolam dilakukan ekstraksi DNA, kemudian dilakukan pemeriksaan kualitas

dan kuantitas DNA, selanjutnya dilakukan pooling farm.

Gambar 4. Diagram Sistem Pooling Sampel untuk qPCR

qPCR

Laporan Hasil Uji (LHU)

Page 29: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 19

BAB IV

EVALUASI DAN PELAPORAN SURVEILAN MEGALOCYTIVIRUS

4. 1. Format Pelaporan

UPT KIPM dan UPT DJPB yang telah selesai melaksanakan kegiatan

surveilan dan telah selesai Laporan Hasil Ujinya, segera membuat laporan

kegiatan. Hasil surveilan Megalocytivirus dilaporkan menggunakan format

Lampiran 1.

4. 2. Mekanisme Pelaporan

Laporan hasil pelaksanaan kegiatan disampaikan dalam bentuk soft

copy dan ditujukan ke Kepala Pusat Karantina dan Keamanan Hayati Ikan

dengan alamat email: [email protected], dan ke Direktorat

Kesehatan Ikan dan Lingkungan dengan email:

[email protected]. Sedangkan Laporan dalam bentuk

hardcopy (CD) dikirim melalui alamat:

Pusat Karantina dan Keamanan Hayati Ikan,

Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan

Gedung Mina Bahari II Lantai 6

Jl. Medan Merdeka Timur No. 16, Jakarta Pusat

Jakarta 10110

Direktorat Kesehatan Ikan dan Lingkungan,

Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya

Gedung Mina Bahari IV Lantai 7

Jl. Medan Merdeka Timur No. 16, Jakarta Pusat

Jakarta 10110

Page 30: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 20

4. 3. Waktu Pelaporan

Laporan pelaksanaan surveilan Megalocytivirus disampaikan ke Pusat

Karantina dan Keamanan Hayati Ikan dan Direktorat Kesehatan Ikan dan

Lingkungan dengan ketentuan :

1. Per-kegiatan surveilan Megalocytivirus, selambat-lambatnya 1 (satu)

minggu sebelum digunakan sebagai dasar penerbitan Health

Certificate;

2. Akhir pelaksanaan kegiatan surveilan Megalocytivirus (tahunan),

selambat-lambatnya 1 (satu) minggu sebelum akhir tahun.

Page 31: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 21

BAB V

PENUTUP

Kegiatan surveilan Megalocytivirus memerlukan dukungan

sumberdaya manusia, sarana, prasarana dan dana yang memadai serta

dilakukan secara terpadu dengan melibatkan semua komponen tim, baik

pusat, unit pelaksana teknis, para pakar/ahli penyakit ikan serta

pembudidaya. Untuk itu kegiatan surveilan Megalocytivirus memerlukan

adanya petunjuk teknis serta kebijakan yang integratif.

Dengan tersusunnya Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada

Ikan Hias Tawar dan Laut ini, diharapkan pelaksanaan kegiatan surveilan

yang dilaksanakan oleh Tim Surveilan dapat lebih terukur, terarah, dan

hasilnya dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah.

Page 32: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 22

DAFTAR PUSTAKA

Abidin, L.O.B., 2013, Deteksi Molekuler Megalocytivirus pada Ikan Budidaya

dengan Metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment

Length Polymorphism. Tesis Program Studi Bioteknologi Sekolah

Pascasarjana UGM. Yogyakarta.

Andrew M. Q. King, Michael J Adams, Eric B. Carstens and Elliot J. Lefkowitz.,

2012. Virus Taxonomy. Ninth Report of the International Committee on

Taxonomy of Viruses. International Union of Microbiological Societies.

Virology Division. Elsevier Academic Press.

Cameron, A. R. 1999. Survey Toolbox. A Practical Mannual and Software

Package for Active Surveillance of Livestock Disease in Developing

Countries. Monograph. Vol. 54. ACIAR, Australian Center for

International Agricultural Research.

Chao, C.B., C.Y. Chen, Y.Y.Lai, C.S. Lin and H.T. Huang. 2004. Histological,Ultrastructural, and in situ Hybridization Study on Enlarged Cells inGrouper Ephinephelus Hybrids Infected by Grouper Iridovirus in Taiwan(TGIV). Dis. Aquat. Org., 58:127-142

Chinchar VG, Essbauer S, He JG, Hyatt A, Miyazaki T, Seligy V, Williams T(2005). "Family Iridoviridae 145-162. In Fauquet CM, Mayo MA, ManiloffJ, Desselburger U, Ball LA (eds). Virus Taxonomy, Eighth report of theInternational Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press,San Diego, USA

Corsin, F., M. Georgiadis, K. L. Hammell, B. Hill. 2009. Guide fo Aquatic Animal

Health Surveillance. Published by The World Organization for Animal

Health (OIE)

Mahardika, K., I. Koesharyani, K. Sugama, A. Priyono and K. Yuasa. 2001.Histopathological Study of Iridovirus Infection in Epinephelus coioidesand Epinephelus bleekeri. In: Sugama K, Ikenou H, Kawahara S(eds)Proceedings of Mariculture Technology and Sea FarmingDevelopment. Jakarta, Indonesia. Japan International CooperationAgency, Jakarta, P 334-341.

Mahardika, K., I. Koesharyan, A. Prijono and K. Yuasa. 2003. Infeksi Iridoviruspada Induk Kerapu Lumpur (Epinephelus coioides) Jurnal PenelitianPerikanan Indonesia. Edisi Akuakultur, 9 (1): (11-15).

Mahardika, K., Zafran, A. Yamamoto, and T. Miyazaki. 2004a. Susceptibility ofJuvenile Humpback Grouper (Cromileptes altivelis) to Grouper SleepyDisease Iridovirus (GSDIV). Dis Aquat Org. 59:1-9.

Page 33: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 23

Mahardika, K., I. Koesharyani and Zafran. 2004b. Uji Kerentanan Ikan KerapuLumpur, Epinephelus coioides dan Kerapu Batik, Epinephleusmicrodon terhadap Infeksi Iridovirus. Jurnal Penelitian PerikananIndonesia, Edisi Akuakultur, 10 (2): 83-88.

Mahardika, K., Haryanti, A. Muzaki and T. Miyazaki. 2008. Histopathologicaland Ultrastructural Features of Enlarged Cells of Humpback GrouperCromileptes altivelis Challenged with Megalicytivirus (FamilyIridoviridae) after Vaccination. Dis. Aquat. Org., 79: 163-167.

Mahardika, K., and T. Miyazaki. 2009a. Electron Microccopic Features ofCulture Grunt Fin Cells Infected with Megalocytivirus. Aquaculture Sci.,57 (1): 9-18.

Mahardika, K. A. Muzaki and K. Suwirya. 2009b. Pathogenecity of GrouperSleepy Disease Iridovirus (GSDIV: Megalocytivirus, Family Iridovirdae) toCoral Trout Grouper Plectrophomus leopardus. IndonesianAquaculture Journal, 4 (2): 121-130.

Mahardika, K. I. Mastuti and Haryanti. In Pres. Effectivity of Inactive GSDIV(Grouper Sleepy Disease Iridovirus) Vaccine in Grouper Fish(Cromileptes altivelis and Epinephleus fuscoguttatus) Against GSDIVInfection. Indonesia Aquiaculture Journal, 27.

Martin, S. W. A. H. Meek, P. Willberg. 1987. Veterinary Epidemiology, Principles

and Methods. Iowa State Univeristy Press/Ames. Pp.: 24-27.

Mastuti, I., Y.N. Asih and K. Mahardika. 2010. Quantitative HistopathologicalAnalysis of Enlarged Cells Derived from Humpback Grouper.Cromileptes altivelis Infected with Grouper Sleepy Disease Iridovirus(GSDIV). Indonesian Aquaculture Journal, (2): 91-100.

Miyazaki, T. 2007. Color Atlas of Fish Histopathology, Vol.2. Shin-SuisanShimbun-Sha, Tokyo, Japan, P 325-335.

Nolan D1, Stephens F, Crockford M, Jones JB, STidakw M. 2014. Detection and

Characterization of Viruses of the Genus Megalocytivirus in

Ornamental Fish Imported into an Australian Border Quarantine

Premises: an Emerging Risk to National Biosecurity. J Fish Dis 2014 Jan

30. doi: 10.1111/jfd.12222.

Owen, L., 1993. Report On Sleepy Grouper Disease. Deprt. of Biomedical andTropical Veterinary Science, James Cook Univ. of North QueenslandTownville, Austalia. 4811

Petrie, A and Watson, P. 2006. Statistics for Veterinary and Animal Science.

Blackwell Publishing. Hongkong.

Page 34: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 24

Rimmer, A.E., Joy A. Becker, Alison Tweedie, Richard J. Whittington. 2014.

Development of a Quantitative Polymerase Chain Reaction (Qpcr)

Assay for the Detection of Dwarf Gourami Iridovirus (DGIV) and Other

Megalocytiviruses and Comparison with the Office International des

Epizooties (OIE) Reference PCR Protocol. Aquaculture 358–359 (2012)

155–163.

Subramaniam K., Shariff M., Omar A.R., and Hair-Bejo M.: Megalocytivirus

Infection in Fish. Rev. Aquaculture 2012; 4: pp. 221-233

Sudthongkong, C., M. Miyata and T. Miyazaki. 2002. Iridovirus Disease in TwoOrnamental Tropical Freshwater Fishes: African Lampeye and DwarfGourami. Dis Aquat Org, 48:163-173.

Sung, C., Chi, S., Huang, K., and Lu, J., 2010, Rapid Detection of Grouper

Iridovirus by Loop-mediated Isothermal Amplification. J. Marine Syst.,

18: 568-573.

Thrusfield M. 2007. Veterinary Epidemiology. 2nd edition. Blackwell, London.

Yanong RPE, Waltzek TB (2010). "Megalocytivirus Infections in Fish, withEmphasis on Ornamental Species." University of Florida Institute ofFood and Agricultural Sciences Extension

Page 35: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 25

Lampiran 1. Pencatatan dan Pelabelan

Semua data terkait dengan sampel dicatat secara lengkap sejarah

spesimen (ikan sampel) pada saat pengumpulan:

a) Pengamatan gejala klinis di lapangan seperti data dasar (nama

pemilik, alamat, pendidikan), spesies yang ikan yang dibudidayakan,

umur, ukuran, asal (liar, budidaya, nomor farm, kolam dll.),

b) Semua catatan lain yang diperlukan (kuesioner).

Pelabelan harus disertakan bersama spesimen selama fiksasi, penyimpanan

dan transportasi ke laboratorium.

Selalu menggunakan pensil 2B dan dicatat pada label yang tahan air,

jangan menggunakan balpoint karena akan larut dalam alkohol.

Gambar 5. Sampel dimasukkan dalam botol jenis PE dan pelabelan

menggunakan pensil 2B pada kertas yang direndam dalam

larutan alkohol 80% atau fiksatif.

Page 36: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 26

Lampiran 2. Kuesioner

Faktor risiko terkait terjadinya wabah Megalocytivirus adalah melalui

informasi dari kuesioner. Kuesioner dikembangkan untuk mendapatkan data

sekunder terkait dengan identitas pembudidaya, sumber benih ikan, aspek

biosekuriti yang dilakukan oleh pembudidaya, aspek biosekuriti yang

dilakukan oleh pengepul (second man), dan aspek biosekuriti yang

dilakukan di pihak eksportir.

Informasi terkait dengan data dasar meliputi nama pembudidaya,

alamat tempat berbudidaya, asal mendapatkan benih, telur atau induk,

biosekuriti yang dilakukan oleh pembudidaya terkait dengan sumber air dan

perlakuan air, cara isolasi terhadap pengaruh luar atau sumber infeksi dll.

Selain itu juga data kemana ikan yang dihasilkan dijual.

Biosekuriti di tingkal pengepul (second man) berisi tentang nama,

alamat domisili, fasilitas, teknik biosekuriti, asal mereka mendapatkan ikan,

perlakuan selama pemeliharaan di tingkat pengepul, seperti pemberian

pakan (jenis, dosis), obat yang digunakan, kejadian kematian selama

karantina dan target pemasaran.

Informasi di tingkat eksportir adalah tentang nama dan alamat domisili

perusahaan, informasi dari mana mereka mendapatkan pasokan ikan,

fasilitas penampungan ikan, biosekuriti yang dilakukan, perlakuan selama

penampungan, seperti jenis pakan dan obat-obatan yang digunakan,

apakah terjadi kematian, dan negara target ekspor.

Page 37: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 27

Data Kuesioner

Nama

Pewawancara

Tanggal Data

ID

Provinsi Kabupaten

Kecamatan Desa

Farm ID Pemilik

Farm

Jenis

kelamin

o M

o F

Usia

(thn)

Nomor yang

Bisa Dihubungi

Berapa kolam yang

dimiliki

Dari mana sumber

air untuk kolamnya

o Air sungai

o Air sumur

o Lain2 (sebutkan)

Tipe pengelolaan air

yang digunakan

o Air dari sumber langsung digunakan tanpa perlakuan

o Air disterilkan dengan bahan desinkfektan (sebutkanjenis, dosis)

o Air ditampung dalam tandon

Sistem pembuangan

limbah

o Dibuang langsung ke perairan umum

o Ditampung dalam petak penampungan dandiperlakukan dengan bahan kimia/desinfektan

o Limbah ditampung tanpa ditreatmen dan dibuanglangsung ke perairan umum

Tipe kolam o Bak semen

o Bak fiber

o Kolam lapis plastik

o Kolam tanah, tanah liat

o Lain-lain (Sebutkan)

Kehilangan air

harian

o <10%

o 10-30%

o >30%

Page 38: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 28

Apakah digunakan

aertor di kolam?

o Ya

o Tidak

Tipe aerator o Kincir

o Blower

o AirO2

o Lain-lain (sebutkan)

Pengamatan

selama

pemeliharaan

o Air berbusa di permukaan

o Air berwarna kemerahan

o pH turun mendadak

o plankton blooming (warna)

Lokasi kolam

(koordinat GPS)

Apakah ada farm sekitar tempat usaha?, berapa jaraknya? o Ya

o Tidak

Informasi tentang kasus penyakit

atau kematian ikan di lokasi.

o Tidak ada

o Ada, jumlah besar (penyebab tidakdiketahui)

o Jenis penyakit, apabilaada....................................

Spesies ikan o ……….

o ……….

o ……….

Asal ikan o Wild stock

o Culture stock

Jenis pakan yang

digunakan?

o Ikan rucah

o Pakan buatan/pelet merek ....................................

o Lain-lain, sebutkan.............................................

Penyimpanan

pakan

o Cool storage

o DI simpan dengan cara tertentu,sebutkan...................................

Berapa lama

pakan disimpan

o Kurang dari 3 hari

o 3-7 hari

o >7 hari

Sumber

induk/telur/larva

Apakah ada pengecekan kesehatan? Ya tidak

DGIV RSIV

o Ya

o Tidak

o Ya

o Tidak

o o

o Ya

o Tidak

o Ya

o Tidak

o o

Page 39: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 29

o Ya

o Tidak

o Ya

o Tidak

o o

Apakah ada

perlakuan

terhadap ikan

yang baru datang

o Ditampung di wadah terpisah

o Diinkubasi selama 3-7 hari

o Benih baru datang dilakukan treatmen,sebutkan..................

o Benih langsung ditebar di kolam

Apakah ada

kematian, berapa

persen

o Tidak

o Ya

o < % perhari

o 1-5 % perhari

Apakah ikan

menunjukkan

gejala klinis,

seperti berenang

tidak teratur

o Ya, berupa ………………..

o Tidak

Pembuangan

limbah

o Tidak membuang limbah

o Membuang limbah langsung ke perairan umum

o Limbah ditampung dan ditreatmen

Apakah ada

perlakuan khusus

bagi pengunjung

o Ada

o Tidak

Apakah farm

memiliki fasilitas

footbath

o Ada

o Tidak

Jumlah ikan yang

diambil untuk

sampel

Jumlah

kolam

disampel

........................., tanggal ...... bulan, ....tahun

Pewawancara Pemilik farm,

(Nama Terang) (Nama Terang)

*) Coret yang tidak perlu

Page 40: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 30

Lampiran 3. Prosedur qPCR Menggunakan Hydrolysis Probe

1. Peralatan

- alat pengukur konsentrasi DNA berbasis spektrofotometri UV;

- freezer (-20°C atau lebih rendah);

- heating block atau waterbath;- laminar flow;- mesin real-time PCR;- mini mixer.- mikropipet berbagai ukuran 0,1 µl – 1 000 µl;- alat bedah pinset dan gunting;- rak blok es;- sentrifus;- mini sentrifus- peralatan gelas- timbangan analitik dengan ketelitian 0,1 mg.

2. Bahan

- bufer tris EDTA (TE) (konsentrasi 10 mM Tris HCl 1 mM EDTA pH 7,5 );

- nuclease-free water;

- etanol p.a;- filtered microtip berbagai ukuran 10 µl – 1 000 µl ;- isopropanol (2-propanol);- kloroform;- kit real-time PCR komersial compatible dengan TaqMan®probe;- larutan ekstraksi DNA komersial;- larutan penghambat DNAse;- masker;- penggerus jaringan (pellet pestle);- plasmid standar positif Megalocytivirus;- sarung tangan (powder-free);- 1 set primer dan probe (AAHL-CSIRO, 2013:

Primer RSIV RT F: 5’-TGACCAGCGAGTTCCTTGACTT-3’

Primer RSIV RT R: 5’-CATAGTCTGACCGTTGGTGATACC-3’

RSIV probe : 5’-6FAM AAC GCCTGCATGATGCCTGGC TAMRA-3’

- tabung mikro ukuran 0,2 ml; 1,5 ml – 2 ml;- tabung atau microplate PCR optikal ukuran 0,1 ml - 0,2 ml atau tabung

kapiler ukuran 20 µl - 100 µl.

CATATAN : Bahan disesuaikan dengan metode standar yang digunakan

Page 41: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 31

3. Prosedur

3.1. Persiapan Contoh Uji

- Ikan ukuran kecil (kurang dari 1 cm), maka ambil contoh uji secara

utuh.

- Ikan ukuran sedang (ukuran 1 cm – 6 cm) makan ambil contoh uji

dari insang, hati dan limpa.

- Ikan ukuran besar (ukuran lebih dari 6 cm) ambil contoh uji dapat

dari insang, hati dan limpa baik segar maupun beku (-20°C) atau

yang sudah diawetkan dalam larutan preservatif DNA.

3.2. Ekstraksi DNA dengan Metode Presipitasi

- Masukkan 20 mg contoh uji ke dalam tabung mikro 1,5 ml.

- Tambahkan 600 µl larutan kit ekstraksi DNA komersial Dodecyl

trimethyl bromide-ammonium (DTAB), homogenkan menggunakan

penggerus pelet.

- Inkubasikan pada 75°C selama 5 menit , dan dinginkan pada 25°C.

- Tambahkan 700 µl kloroform.

- Tutup tabung mikro dan kocok dengan minimixer selama 20 detik

- Sentrifugasi contoh uji pada 12 000 x g selama 5 menit.

- Pindahkan 200 µl cairan lapisan paling atas ke dalam tabung mikro

baru.

- Tambahkan larutan kit ekstraksi Cetyl trimethylammonium bromide

(CTAB) sebanyak 100 µl dan ddH2O sebanyak 900 µl.

- Kocok dengan minimixer dan inkubasikan pada 75°C selama 5

menit,

- Sentrifugasi pada 12000 x g selama 5 menit, pindahkan cairan

bening ke dalam tabung mikro baru yang berisi 300 µl etanol 95%.

- Homogenkan dengan minimixer

- Sentrifugasi pada 12 000 x g selama 5 menit.

- Buang supernatan, cuci pelet dengan 200 µl etanol 75%,

sentrifugasi pada 7 500 xg selama 2 menit.

Page 42: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 32

- Keringanginkan pelet DNA, larutkan pelet DNA dengan ddH2O

atau TE buffer.

- Simpan larutan DNA pada -20°C apabila segera digunakan dan

untuk penyimpanan lebih lama pada freezer dengan suhu yang

lebih rendah (<-40°C) dalam bentuk alikuot.

CATATAN : Prosedur metode ekstraksi DNA disesuaikan dengan kit

komersial yang digunakan

3.3. Pengukuran DNA

- Ukur konsentrasi DNA dengan alat pengukur konsentrasi DNA pada

panjang gelombang 260 nm.

- Periksa kemurnian DNA dengan menghitung perbandingan hasil

pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan

280 nm (Å260/ Å280);

- Lakukan pengenceran apabila konsentrasi yang diperoleh lebih

tinggi dari yang diperlukan;

- Simpan larutan DNA pada -20°C apabila tidak langsung

digunakan.

3.4. Amplifikasi

- Cairkan DNA template, Quantitect 2x PCR Master Mix, primer,

probe, Nuclease-free water dengan meletakkan di atas rak blok es

- Buat preparasi master mix sesuai dengan Tabel 1. Siapkan volume

mastermix n+1, (n= setiap 10 jumlah reaksi) lebih banyak dari yang

dibutuhkan. Contoh uji minimal dianalisis secara duplo

- Homogenkan semua bahan master mix dan distribusikan ke

masing-masing tabung/plate PCR optikal.

- Masukkan 2 μl template DNA (10 ng - 100 ng) contoh uji, kontrol

positif ekstraksi; kontrol negatif ekstraksi, kontrol positif amplifikasi

Page 43: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 33

(DNA); kontrol negatif amplifikasi (NTC); dan 4 standar positif (10

copies; 102 copies; 103 copies; 104 copies).

- Lakukan amplifikasi dengan real time PCR, dengan kondisi sesuai

Tabel 2.

CATATAN 1 Seluruh proses preparasi reagen dilakukan pada kondisi dingin.

CATATAN 2 Prosedur metode amplifikasi disesuaikan dengan kit komersial yang

digunakan.

CATATAN 3 Untuk kebutuhan diagnosis cepat dapat menggunakan kontrol positif

amplifikasi (DNA), 4 standar positif (10 copies; 102 copies; 103 copies; 104

copies) dan kontrol negatif amplifikasi (NTC).

Tabel 1 - Komposisi Koktail untuk qPCR

No. Komponen Volume/Reaksi (μl) Konsentrasi Akhir

1. Quantitect 2x PCR master mix 12,5 1 x

2. Primer Forward (20 μM) 0,5 0,4 μM

3. Primer Reverse (20 μM) 0,5 0,4 μM

4. Probe (10 μM) 0,5 0,2 μM

5. DNAase free water 9 -

6. DNA Template 2 10 ng-100 ng

Total Volume 25

CATATAN komposisi koktail disesuaikan dengan kit komersial yang digunakan

dan sudah divalidasi

Tabel 2 - Program Amplifikasi

Proses Suhu (oC) Waktu Siklus

enzyme activation 50 2 menit 1

PCR initial activation 95 15 menit 1

Denaturasi 95 15 detik40

Annealing/extention 60 60 detik

CATATAN Profil amplifikasi disesuaikan dengan manual kit dan mesin

real time PCR yang digunakan

Page 44: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 34

3.5. Interpretasi hasil

Analisis data sesuai dengan software real-time PCR yang digunakan.

a) Pengamatan setelah analisis data amplifikasi

Interpretasi kurva amplifikasi adalah sebagai berikut:

- contoh uji dinyatakan positif apabila terlihat naiknya kurva di atas

garis threshold/cut off dan nilai Ct lebih kecil atau sama dengan

LoD.

- semakin cepat naik/munculnya kurva dan memotong garis

threshold/cut off menunjukkan jumlah copy DNA virus yang

semakin banyak (konsentrasinya tinggi)

- contoh uji dinyatakan negatif apabila berada dibawah garis

threshold/cut off dan nilai Ct lebih besar dari LoD dengan tingkat

kepercayaan (confident level) 95%.

b) Kuantifikasi copy virus

- Jumlah copy virus dapat dilihat pada tabel laporan kuantifikasi di

perangkat lunak komputer yang terhubung dengan mesin real-

time PCR yang digunakan.

- Kurva Standar disajikan pada gambar 1 dan tabel 3

- Berdasarkan Tabel 4 hasil pengujian dapat dianalisis sebagai

berikut :

1) contoh uji dinyatakan positif apabila konsentrasi sama atau

lebih dari nilai LoD 10 copies (B1 dan B2, C1 dan C2)

2) contoh uji dinyatakan negatif apabila nilai konsentrasi kurang

dari nilai LoD 10 copies (A1 dan A2 ).

Page 45: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 35

Kurva Standar

Gambar 6 – Kurva standar

Page 46: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 36

Tabel 3 - Keterangan Gambar Kurva Standar Hasil Amplifikasi Real Time

No. Colour Name Type Ct Given Conc(copies/ul)

Calc Conc(copies/ul)

% Var

1 Standar Megalocytivirus 10^4 (1) Standard 26.34 10,000.0 13,206.3 32.1%

2 Standar Megalocytivirus 10^4 (2) Standard 26.37 10,000.0 12,970.7 29.7%

3 Standar Megalocytivirus 10^3 (1) Standard 30.48 1,000.0 655.8 34.4%

4 Standar Megalocytivirus 10^3 (2) Standard 30.30 1,000.0 748.9 25.1%

5 Standar Megalocytivirus 10^2 (1) Standard 33.61 100.0 68.1 31.9%

6 Standar Megalocytivirus 10^2 (1) Standard 32.82 100.0 121.0 21.0%

7 Standar Megalocytivirus 10^1 (1) Standard 36.01 10.0 12.0 20.0%

8 Standar Megalocytivirus 10^ 1(2) Standard 36.00 10.0 12.0 20.1%

9 Sampel negatif amplifikasi (1) NTC

10 Sampel negatif amplifikasi (2) NTC

Page 47: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 37

Kurva Hasil Pengujian Sampel

Gambar 7 – Kurva Pengujian Sampel

Page 48: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 38

Tabel 4 - Keterangan Gambar Pengujian Sampel Hasil AmplifikasiReal Time

No. Colour Name Type CtGiven Conc

(copies/ul)

Calc Conc

(copies/ul)% Var

1 Standar Megalocytivirus 10^4 (1) Standard 26.34 10,000.0 13,206.3 32.1%

2 Standar Megalocytivirus 10^4 (2) Standard 26.37 10,000.0 12,970.7 29.7%

3 Standar Megalocytivirus 10^3 (1) Standard 30.48 1,000.0 655.8 34.4%

4 Standar Megalocytivirus 10^3 (2) Standard 30.30 1,000.0 748.9 25.1%

5 Standar Megalocytivirus 10^2 (1) Standard 33.61 100.0 68.1 31.9%

6 Standar Megalocytivirus 10^2 (1) Standard 32.82 100.0 121.0 21.0%

7 Standar Megalocytivirus 10^1 (1) Standard 36.01 10.0 12.0 20.0%

8 Standar Megalocytivirus 10^ 1(2) Standard 36.00 10.0 12.0 20.1%

9 Contoh Uji A (1) Unknown 37.48 4.1

10 Contoh Uji A (2) Unknown 37.96 2.9

11 Contoh Uji B (1) Unknown 35.41 18.5

12 Contoh Uji B (2) Unknown 35.79 14.0

13 Contoh Uji C (1) Unknown 26.44 12,284.3

14 Contoh Uji C (2) Unknown 26.11 15,646.6

15 Sampel negatif amplifikasi (1) NTC

16 Sampel negatif amplifikasi (2) NTC

17 Sampel negatif ekstraksi (1) NTC

18 Sampel negatif ekstraksi (2) NTC

Page 49: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 39

4. Jaminan Mutu Pengujian

- Proses ekstraksi DNA dijamin kualitasnya dengan menyertakan

kontrol positif ekstraksi (positive extraction control, PEC) dan kontrol

negatif ekstraksi (NEC) dan menunjukkan hasil yang konsisten atau

dengan menggunakan reference gene.

- Hasil ekstraksi DNA mempunyai rasio A 260/ A280 berkisar 1,8 – 2,0

- Proses amplifikasi dijamin kualitasnya dengan menyertakan kontrol

positif amplifikasi (positive amplification control, PAC) dan kontrol

negatif amplifikasi (NAC) menunjukkan hasil yang konsisten.

- Efisiensi amplifikasi dinyatakan baik apabila mempunyai nilai 0,9 –1,1.

- Proses real time PCR valid bila dilihat dari kurva standar dengan nilai

koefisien determinasi (R2 ) > 0,95.

- Keterulangan (Repeatability) untuk pengujian duplo harus

mempunyai nilai standar deviasi (SD) Ct lebih kecil dari 0,5.

CATATAN Jika ditampilkan sebagai persentase variabilitas (% Var), maka

pengujian duplo harus mempunyai nilai SD Cq lebih kecil dari 50%.

Page 50: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 40

Lampiran 4. Deteksi Megalocytivirus (RSIV, ISKNV, DGIV) Menggunakan PCR

Double Step (Nested) ( Rimmer, et al 2012)

1. Alat : Daftar Alat yang Diperlukan

- Timbangan Analitik

- Autoclave

- Glassware

- Dissecting set

- Mikropipet (0,1-3 μl, 0,5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl dan 100-1000 μl)

- Hot plate and stirer

- Vortex mixer

- Thermal block atau oven incubator

- pH meter

- Laminary Air Flow Cabinet

- Deep freezer

- Refrigerator

- Mini Centrifuge

- Gel elektrophoresis chamber

- Thermal Cycler (mesin PCR)

- Gel Documentation System (UV Doc)

- PCR Cooler Block

2. Bahan : Daftar Bahan yang Diperlukan

- Bahan ekstraksi DNA

- Mikrotube (1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml)

- Mikrotip (10-100 μl, 100-1000 μl, 1000 μl)

- Agarosa

- DNA Ladder (100 bp)

- Hot-StarTaq Master Mix (Qiagen)/Gotaq Green® Master mix.

- TE-buffer (Tris-EDTA Buffer)

- Nuclease-free water (NFW)

- SYBR Safe DNA Gel Stain

- Kontrol Positif Megalocytivirus

- Primer (table 5)

*Penyimpanan reagen suhu - 20°C

Page 51: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 41

Table 5. Primer yang Digunakan pada Uji Megalocytivirus

Amplifikasi Sequence PrimerTarget Produk

PCR

First

F: C1105 (5’- GGGTTCATCGACATCTCCGCG - 3’ )

430 bp

F: C1106 (5’- AGGTCGCTGCGCATGCCAATC - 3’)

Nested

F: C1073 (5’- AATGCCGTGACCTACTTTGC - 3’)

167 bp

R: C1074 (5’- GATCTTAACACGCAGCCACA - 3’)

3. Prosedur Kerja

Ekstraksi (DNA)*

- Keringkan spesimen menggunakan tissue steril.

- Timbang sejumlah 20 miligram.

- Masukkan ke dalam tabung mikro steril berukuran 1,5 ml, lalu beri

600 μl reagen DTAB.

- Haluskan spesimen menggunakan pestle.

- Inkubasi pada 75oC selama 5 menit. Setelah selesai dinginkan

tabung mikro sampai suhu ruang.

- Tambahkan 700 mikroliter kloroform ke dalam tabung mikro.

- Vorteks selama 10 detik.

- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit.

- Pindahkan cairan bening yang terdapat di bagian atas tabung

mikro ke dalam tabung mikro yang baru.

- Tambahkan 100 μl reagen CTAB dan 900 μl dd. H2O ke dalam

tabung mikro yang baru (poin 9).

- Vorteks selama 10 detik.

- Inkubasi pada 75oC selama 5 menit. Setelah selesai, turunkan suhu

tabung sampai suhu ruang.

- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 10 menit.

Page 52: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 42

- Buang supernatan dengan hati-hati agar pelet tidak ikut

terbuang.

- Larutkan pelet menggunakan 150 μl reagen Dissolve Solution.

- Inkubasi pada 75oC selama 5 menit. Setelah selesai, turunkan suhu

tabung mikro sampai suhu ruang.

- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit.

- Pindahkan cairan bening di bagian atas tabung mikro ke dalam

tabung mikro yang baru.

- Tambahkan 300 µl Ethanol PA 95%.

- Vorteks selama 10 detik.

- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit.

- Buang supernatan, lalu keringkan pelet dengan cara membalik

tabung di atas kertas tissue steril.

- Tambahkan TE Buffer sebanyak 100 µl

- Simpan pada suhu -200C sampai akan digunakan dalam

amplifikasi.

* Dapat menggunakan ekstrasi DNA lainnya.

3.1. First Step

- Buat master mix berisi campuran primer C1105(F), C1106 (R),

Go Taq Green, NFW ditambah 2 kontrol (+/-) untuk first step.

- Beri label pada microtube 0.2 ml sesuai dengan kebutuhan

sampel dan kontrol.

- Siapkan volume master mix (n+1, n= jumlah reaksi) lebih

banyak dari volume yang dibutuhkan dengan formulasi.

Komposisi reagen untuk setiap proses amplifikasi dapat di

lihat pada tabel di bawah ini :

Page 53: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 43

Table 6. Komposisi Mastermix PCR

Komponen Volume (µl)

10µ M F 1

10µ M R 1

Go Taq Green 12.5

Template (DNA)* 4

NFW 6.5

Total Per Reaksi 25

- Distribusikan master mix pada tiap tabung reaksi @ 21

mikroliter

- Template DNA dan control negative berupa NFW

dimasukkan sebanyak 4 mikroliter/reaksi kecuali control

positive.

- Amplifikasi dalam mesin PCR sesuai profil amplifikasi first step

Megalocityvirus seperti table dibawah ini.

Tabel 7. Profil Amplifikasi First PCR

Siklus Temperature Waktu

1 950 C 15 menit

30940 C 30 detik

55 30 detik

720 C 1 menit

1 720 C 7menit

Ukuran Amplicon 430 bp

3.2. Nested

Cara Kerja

- Primer C1073 (F), C1074 (R), Go Taq Green, dan NFW

dicampurkan sama dengan jumlah pada reaksi awal.

- Beri label pada microtube 0.2 ml sesuai dengan kebutuhan

sampel dan kontrol.

Page 54: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 44

- Master mix disiapkan dengan volume (n+1, n= jumlah reaksi)

lebih banyak dari volume yang dibutuhkan kemudian master

mix didistribusikan pada tiap tabung reaksi @ 23 µl. Komposisi

reagen pada proses amplifikasi dapat dilihat pada tabel di

bawah ini :

Tabel 8. Komposisi Mastermix Nested PCR

Komponen Volume (µl)

10µ M F 1

10µ M R 1

Go Taq Green 12.5

Template (DNA)* 2

NFW 8.5

Total Per Reaksi 25*

- Amplikon pada reaksi awal dimasukkan sebanyak @ 2µl/

reaksi.

- Amplifikasi dalam mesin PCR sesuai profil amplifikasi nested

Megalocityvirus pada tabel di bawah ini :

Tabel 9 Profil Amplifikasi nested PCR

Siklus Temperature Waktu

1 950 C 15 menit

30940 C 30 detik

55 30 detik

720 C 1 menit

1 720 C 7 menit

Ukuran Amplicon 167 bp

4. Deteksi Produk PCR

- Konsentrasi agarose 1,5% w/v dalam TAE 1x. Tambahkan

pewarna (SYBR Safe DNA /SYBR green) sebelum agar

dituang/dicetak.

- Masukkan secara beruntun marker/ladder, amplikon sampel,

dan control +/- ke dalam sumur gel sebanyak 8-15µl secara

perlahan. Volume disesuaikan dengan dalamnya lubang sumur.

Page 55: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 45

- Elektroforesis dilakukan dengan kekuatan listrik 100-150 V selama

± 30 menit.

- Amati gel agar dibawah sinar UV untuk melihat visualisasi pita

DNA.

- Bandingkan berat molekul target dengan marker yang

digunakan.

- Dokumentasikan dengan UV Doc.

5. Intepretasi Hasil PCR

Pada First step PCR amplikon yang di elektroforesis dikatakan positif jika

terbaca atau terdapat pita tunggal pada 430 bp. Dan untuk nested

PCR dikatakan positif jika terbaca atau terdapat pita tunggal pada

167 bp.

6. Referensi :

Rimmer AE, Becker JA, Tweedie A, Whittington RJ (2012). Development

of a Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay for

the Detection of Dwarf Gourami Iridoviruses (DGIV) and other

Megalocytiviruses and Comparison with the Office International

des Epizooties (OIE) Reference Protocol. Aquaculture 358-

359:155−163.

Mohr. Peter G, Nicholas J. G. Moody, Lynette M. Williams, John Hoad,

David M. Cummins, Kelly R. Davies, Mark StJ. Crane. 2015.

Molecular Confirmation of Infectious Spleen And Kidney Necrosis

Virus (ISKNV) in Farmed and Imported Ornamental Fish in

Australia. Diseases of Aquatic Organisms. Dis Aquat Org. Vol. 116:

103–110.

Page 56: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 46

Lampiran 5. Format Laporan Surveilan Megalocytivirus

I. Judul

II. Latar Belakang

- Permasalahan terkait dengan penyakit, kerugian secara ekonomi- Perlunya dilakukan kegiatan surveilan- Target patogen- Target lokasi

III. Tujuan

IV. Output

V. Outcome

VI. Metode

- Analisa sampel- Jumlah dan cara pengambilan sampel- Analisa data- Implementasi pengambilan sampel, siapa pelaku, laboratorium

analisa, cara/prosedur data dikirimkan ke yang berkepentinganVII. Hasil dan Pembahasan

- Hasil analisa deskriptif kualitatif terkait dengan jumlah sampelmasuk, proporsi sampel, prevalensi penyakit

- Hasil analisa faktor risikoVIII. Kesimpulan dan saran

IX. Rekomendasi

- Tindak lanjut hasil surveilan- Cara pengendalian penyakit- Upaya menurunkan prevalensi dan penetapan area bebas

penyakit

Page 57: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

47

Lampiran 6. Jadwal Pelaksanaan Surveilan Megalocytivirus

2015 2016 2017

Des Jan Feb Mart Apr Mei Jun Jul Agus Sep Okt Nov Des Jan Feb Mar Apr Mei Jun Jul Agus Sept Okt Nov

Surveilence 4 bln (2x)

E1 E2

S1 S2

survei 8 bln (2x)

E3 E3 E4 E4

S3 S4

Survei 12 bln (3 x)

E5 E5 E6 E6 E7 E7

S5 S6 S7

Survei 24 bulan (4 x)

E8 E8 E8 E9 E9 E9 E10 E10 E10

S8 S9 S10

Page 58: 02. Cover & Tim Penyusun Juknis Surveilan Megalocityvirusgorontalo.bkipm.kkp.go.id/bkipmnew/public/files/regulasi/02. Juknis...PETUNJUK TEKNIS Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias

PUSAT KARANTINA DAN KEAMANAN HAYATIJalan Medan Merdeka Timur No. 16Gedung Mina Bahari II Lantai 6 Jakarta Pusat 10110Telp.: (021)3513277, Faks.: (021) 3513275

DAN KEAMANAN HAYATI IKANJalan Medan Merdeka Timur No. 16Gedung Mina Bahari II Lantai 6 Jakarta Pusat 10110Telp.: (021)3513277, Faks.: (021) 3513275