TUGAS KIMIA ANALITIK

Hight performance liquid chromatography (HPLC) dan gas Kromatografi (GC)

Oleh:

Kelompok VIIAfrianti Ramadhani

Dekna AswitaGusnilawati

Reviana ervitaRezki Pratama

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI PADANG2010

KROMATOGRAFI

A. Pendahuluan

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen-

komponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fasa, salah satu fasa fasa

tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya

sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner.

Fasa stasioner bisa berupa padatan maupum cairan, sedangkan fasa bergerak

bisa berupa cairan maupun gas. Jadi semua jenis kromatografi yang diketahui

diorganisir jadi satu dalam empat kategori yang ditunjukakan dalam tabel sebagai

berikut:

Fasa stasioner padat CairFasa bergerak Cair gas cair GasContoh-contoh Kromatografi

asli Tswett,dengan larutan petroleumeter dan kolom CaCO3,

Kromatografi pertukaran ion

Kromatografi gas-padat, atau GSC

Kromatografi partisi pada kolom silika gel

Kromatografi kertas

Kromatografi gas-cair atau GLC

Seluruh bentuk kromatografi terdiri dari fase diam dan fase gerak. Dalam

seluruh bentuk kromatografi yang lain, anda akan menemui fase gerak adalah cairan.

Dalam kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam

adalah cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan.

Bagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan

tergantung pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan

sebaliknya melekat pada cairan dengan jalan yang sama.

Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlaryt yang dipisahkan bermigrasi

sepanjang kolom (seperti dalam kromatografi kertas atau lapisan tipis, ekivalen fisik

kolom), dasar pemisahan terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan

berbeda. Laju perpindahan sebuah zat terlarut sebagai hasil dari dua faktor, yang satu

cenderung menggerakkan zat terlarut itu, dan yang lain menahannya. Perbedaan kecil

antara dua zat terlarut dalam kekuatan adsorbsi dan dalam interaksinya dalam pelarut

yang bergerak menjadi dasar pemisahan bila zat molekul-molekul zat terlarut itu

berulangkali menyebar diantara dua fasa keseluruh panjang kolom. Ada beberapa cara

untuk mengklasifikasi teknik kromatografi didasarkan atas tipe penamaan dari fasa

(fasa tetap dan fasa bergerak) seperti gas-cairan(GLC), gas-padat (GSC), cairan-

cairan(LLC), dan cairan-padat(LSC). Klasifikasi lain didasarkan pada teknik

penggunaan contohnya.

Teori kromatografi didasarkan pada kesetimbangn distribusi sampel antara

fasa yang ditetapkan oleh konstanta kesetimbangan K, disebut dengan koefisien

distribusi. Rata-rata konsentrasi mengikuti hukum distribusi :

Dimana Cs adalah konsentrasi fasa stasioner dan Cm konsentrasi fasa bergerak.

Laju rata-rata perpindahan molekul ditentukan oleh :

1. Kecepatan molekul pembawa

2. Perbandingan volume fasa stasioner dengan fasa bergerak

3. Koefisien distribusu dari zat terlarut

1. Kromatografi Gas

Kromatografi gas-cair (GLC), atau kromatografi gas (GC), merupakan jenis

kromatografi yang digunakan dalam kimia organik untuk pemisahan dan analisis. GC

dapat digunakan untuk menguji kemurnian dari bahan tertentu, atau memisahkan

berbagai komponen dari campuran. Dalam beberapa situasi, GC dapat membantu

dalam mengidentifikasi sebuah kompleks.

Dalam kromatografi gas, fase yang bergerak (atau "mobile phase") adalah

sebuah operator gas, yang biasanya gas murni seperti helium atau yang tidak reactive

seperti gas nitrogen. Stationary atau fasa diam merupakan tahap mikroskopis lapisan

cair atau polimer yang mendukung gas murni, di dalam bagian dari sistem pipa-pipa

kaca atau logam yang disebut kolom. Instrumen yang digunakan untuk melakukan

kromatografi gas disebut gas chromatograph (atau "aerograph", "gas pemisah").

senyawa gas yang sedang dianalisis berinteraksi dengan dinding kolom yang

dilapisi dengan berbagai tahapan stationary. Ini menyebabkan setiap kompleks ke

elute di waktu yang berbeda, yang dikenal sebagai ingatan waktu yang kompleks.

Perbandingan dari ingatan kali yang memberikan kegunaan analisis GC-nya.

Kromatografi gas yang pada prinsipnya sama dengan kromatografi kolom

(serta yang lainnya bentuk kromatografi, seperti HPLC, TLC), tapi memiliki beberapa

perbedaan penting. Pertama, proses memisahkan compounds dalam campuran

dilakukan antara stationary fase cair dan gas fase bergerak, sedangkan pada

kromatografi kolom yang seimbang adalah tahap yang solid dan bergerak adalah fase

cair. (Jadi, nama lengkap prosedur adalah "kromatografi gas-cair", merujuk ke ponsel

dan stationary tahapan, masing-masing.) Kedua, melalui kolom yang lolos tahap gas

terletak di sebuah oven dimana temperatur gas yang dapat dikontrol, sedangkan

kromatografi kolom (biasanya) tidak memiliki kontrol seperti suhu. Ketiga,

konsentrasi yang majemuk dalam fase gas adalah hanya salah satu fungsi dari tekanan

uap dari gas.

Kromatografi gas juga mirip dengan pecahan penyulingan, karena kedua

proses memisahkan komponen dari campuran terutama berdasarkan titik didih (atau

tekanan uap) perbedaan. Namun, pecahan penyulingan biasanya digunakan untuk

memisahkan komponen campuran pada skala besar, sedangkan GC dapat digunakan

pada skala yang lebih kecil (yakni microscale).

Kromatografi gas terkadang juga dikenal sebagai uap-tahap kromatografi

(VPC), atau gas-cair kromatografi partisi (GLPC). Alternatif nama ini, serta masing-

masing singkatan, sering ditemukan dalam literatur ilmiah.

Diagram alir kromatografi gas-cair

Mekanisme kerja GC

Injeksi sampel

Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin

menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal

(Lempengan karet ini disebut septum) yang mana akan mengubah bentuknya kembali

secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari lempengan karet tersebut.

Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven

tersebut cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh

gas pembawa misalnya helium atau gas lainnya.

Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube

panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase

diam yang berikatan dengan pada bagian terdalam permukaannya.

Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai

4 meter, dengan diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat

disesuakan dengan oven yang terkontrol secara termostatis.Kolom dipadatkan dengan

tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori. Tanah ini dilapisis dengan

cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.

Komponen dalam kromatografi gas :

1. Gas pembawa dan pemasukan sampel

Fase bergerak dalam kromatografi ini adalah gas, yang paling lazim adalah

helium, hidrogen, atau nitrogen. Kompenen pilihan gas spembawa

terutama tergantung pada karakteristik detektor. Kromatografi gas

komersial biasanya menyediakan katup pengatur tambahan untuk

pengendalian tekanan yang baik pada inlet kolom. Dekat inlet kolom ada

suatu alat dimana sampel-sampel dapat dimasuukan kedalam aliran gas

pembawa. Sampel-sampel tersebut bisa berupa gas atau cairan yang mudah

menguap. Lubang injeksi dipanaskan agar sampel cair teruapkan dengan

cepat.

2. Kolom

Aliran gas selanjutnya menemui kolom yang diletakkan dalam oven

bertemperatur konstan. Ini adalah jantung instrumen tesebut, tempat

dimana proses kromartgrafi dasar berlangsung. Kolom memilki variasi

dalam hal ukuran dan bahan isian. Tabung diisi dengan bahan padat halus

dengan luas permukaan besar yang relatif inert. Padatan iitu sebenarnya

hanya sebuah penyangga mekanik untuk cairan, sebelum diisi kedalam

kolom, padatan tersebut diimpregnasi dengan cairan yang diinginkan yang

berpareran sebagai fasa stasioner sesungguhnya. Cairan ini harus stabil dan

nonfolatil pada temperatur kolom, pemisahan dan harus sesuai untuk

pemisahan tertentu.

3. Detektor

Setelah muncul dari kolom itu, aliran gas lewat melalui sis lain detektor.

Maka elusi zat terlarut dari kolom itu mengatur ketidakseimbangan

antaradua sisi detektor yang direkam secara elektrik. Laju aliran gas

pembawa adalah hal yang sangat penting, dan biasanya pengukur aliran

untuk itu tersedia. Secara normal gas-gas yang muncul dialirkan keluar

pada tekanan atmosfir. Karena pekerja laboratorium secara terus menerus

terpapar oleh uap senyawa-senyawa yang terkromatogafi yang mungkin

tak baik walaupun kadarnya biasanya kecil maka ventilasi pada keluaran

instrumen harus diperhatikan. Ketentuan bisa dibuat untuk menjebak zat

terlarut yang dipisahkan setelah muncul dari kolom jika hal ini dibutuhkan

untuk penyelidikan lebih lanjut.

Penerapan kromatografi gas

1. Untuk identifikasi senyawa

Dengan suatu kolom tertentu dan dengan semua fariabelnya seperti

temperatur dan laju alir, dikendalikan secara cermat, waktu retensi atau

volume retensi suatu zat terlarut merupakan suatu besaran dari zat terlarut

tersebut, seperti halnya titk didih atau halnya indek bias adalah besaran. Ini

menunjukkan bahwa sifat retensi dapat digunakan untuk mengetahui suatu

senyawa.

2. Analisis kuantitatif

Dengan GC tergantung pada hubungan antara jumlah suatu zat terlarut dan

ukuran dari pita elusi yang dihasilkan. Secara umum dengan detektor

diferensial, ukuran jumlah zat terlarut yang paling baik adalah luas

dibawah pita elusi. Jumlah zat terlarut = faktor kalibrasi x luas dibawah

pita elusi.

Keterbasan GC adalah volatilitas sampel itu harus mempunyai tekanan uap

yang cukup pada temperatur kolom tersebut, dan ini segera menghilangkan banyak

jenis sampel. Suatu perhitungan yang aktual tidak mungkin dilakukan tetapi harus

diperkirakan bahwa sekitar 20% senyawa kimia yang diketahui kurang cukup

volatil.kebanyakan sampel organik tidak cukup volatil untuk memungkinkan

penerapan langsung dari GC.

Temperatur kolom

Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50 oC sampai 250 oC. Temperatur

kolom lebih rendah daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa komponen

campuran dapat berkondensasi pada awal kolom. Kolom memulai pada temperatur

rendah dan kemudian terus menerus menjadi lebih panas dibawah pengawasan

komputer saat analisis berlangsung.

Proses pemisahan pada kolom

Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran

yang diinjeksikan pada kolom:

Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.

Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam

Molekul dapat tetap pada fase gas

Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.Senyawa yang

mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom secara jelas cenderung

akan berkondensasi pada bagian awal kolom. Namun, beberapa bagian dari senyawa

tersebut akan menguap kembali dengan dengan jalan yang sama seperti air yang

menguap saat udara panas, meskipun temperatur dibawah 1000C. Peluangnya akan

berkondensasi lebih sedikit selama berada didalam kolom.

Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair.

Beberapa senyawa akan lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya.

Senyawa yang lebih mudah larut akan menghabiskan waktunya untuk diserap pada

fase diam: sedangkan senyawa yang suka larut akan menghabiskan waktunya lebih

banyak dalam fase gas.

Proses dimana zat membagi dirinya menjadi dua pelarut yang tidak

bercampurkan karena perbedaan kelarutan, dimana kelarutan dalam satu pelarut satu

lebih mudah dibanding dengan pelarut lainnya disebut sebagai partisi. Sekarang, anda

bisa beralasan untuk memperdebatkan bahwa gas seperti helium tidak dapat

dijelaskan sebagai pelarut. Tetapi, istilah partisi masih dapat digunakan dalam

kromatografi gas-cair.

Substansi antara fase diam cair dan gas. Beberapa molekul dalam substansi

menghabiskan waktu untuk larut dalam cairan dan beberapa lainnya menghabiskan

waktu untuk bergerak bersama-sama dengan gas.

Waktu retensi

Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom

menuju ke detektor disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan waktu

dari saat sampel diinjeksikan pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi puncak

maksimum untuk senyawa itu.

Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu,

waktu retensi sangat bervariasi dan bergantung pada: Titik didih senyawa. Senyawa

yang mendidih pada temperatur yang lebih tinggi daripada temperatur kolom, akan

menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk berkondensasi sebagai cairan pada

awal kolom. Dengan demikian, titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi

yang lama.

Kelarutan dalam fase cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair,

akan mempunyai waktu lebih singkat untuk dibawa oleh gas pembawa.. Kelarutan

yang tinggi dalam fase cair berarti memiiki waktu retensi yang lama.

Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekul-

molekul dalam fase gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap, atau

karena energi atraksi yang tinggi cairan dan oleh karena itu tidak lama tertambatkan.

Temperatur kolom yang tinggi mempersingkat waktu retensi untuk segala sesuatunya

di dalam kolom.

Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan

menggunakan titik didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat

mempunyai pengatur temperatur.

Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda

dapatkan, tetapi akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena

kondensasi yang lama pada bagian awal kolom.

Dengan kata lain, menggunakan temperatur tinggi, segala sesuatunya akan

melalui kolom lebih cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika segala sesuatunya

melalui kolom dalam waktu yang sangat singkat, tidak akan terdapat jarak antara

puncak-puncak dalam kromatogram.

Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu yang rendah kemudian

perlahan-lahan secara teratur temperaturnya dinaikkan.

Pada awalnya, senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam fase gas

akan melalui kolom secara cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit

pertambahan temperatur akan memperjelas perlekatan senyawa. Peningkatan

temperatur masih dapat lebih `melekatan` molekul-molekul fase diam melalui kolom.

Detektor

Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala

dijelaskan pada bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan

lebih mudah untuk dijelaskan daripada detektor alternatif lainnya.

Detektor ionisasi nyala

Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang

sangat kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan

dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron dapat dideteksi.

Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan

temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki nyala

hidrogen yang terbakar dalam air. Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa dalam

campuran anda analisa mulai masuk ke dalam detektor.

Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan elektron-elektron

dalam nyala. Ion positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif dan

elektron-elektron akan beratraksi pancarannya masing-masing yang mana merupakan

anoda.Hal ini serupa dengan apa yang terjadi selama elektrolisis normal.

Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan

menjadi netral. Pada anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada

elektroda positif; ion-ion negatif akan memberikan elektron-elektronnya pada

elektroda dan menjadi netral.

Kehilangam elektron-elektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda

lain, akan menghasilkan aliran elektron-elektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke

katoda. Dengan kata lain, anda akan memperoleh arus listrik.

Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawa-senyawa

organik lebih banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ion-ion, dan

dengan demikian akan terjadi arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah pendekatan yang

beralasan, khususnya jka anda berbicara tentang senyawa-senyawa yang serupa, arus

yang anda ukur sebanding dengan jumlah senyawa dalam nyala.

Kekurangan utama dari detektor ini adalah pengrusakan setiap hasil yang

keluar dari kolom sebagaimana yang terdeteksi. Jika anda akan mengrimkan hasil ke

spektrometer massa, misalnya untuk analisa lanjut, anda tidak dapat menggunakan

detektor tipe ini.

Penerjemahan hasil dari detektor

Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili

satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol

secara hati-hati kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk

membantu mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain

telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah

melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang

dihubungkan dengan monitor. Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang

berwarna hijau dalam gambar yang disederhanakan.

Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area

dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak

tertinggi dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal

seharusnya..

Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti

dari kolom dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area

selain tinggi puncak dapat dipergunakan dalam hal ini.

Perangkaian kromatogram gas pada spektrometer massa

Hal ini tidak dapat dillakukan menggunakan detektor ionisasi nyala, karena

detektor dapat merusak senyawa yang melaluinya. Anggaplah anda menggunakan

detektor yang tidak merusak. Senyawa,

Ketika detektor menunjukkan puncak, beberapa diantaranya melalui detektor

dan pada waktu itu dapat dibelokkan pada spektrometer massa. Hal ini akan

memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan dengan data dasar senyawa

yang telah diketahui sebelumnya pada komputer. Itu berarti bahwa identitas senyawa-

senyawa dalam jumlah besar dapat dihasilkan tanpa harus mengetahui waktu

retensinya.

2. HPLC( Hight Performance Liquid Chromatography)

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari

kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah

grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya

lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil

untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan

yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang

melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-

komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom

mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini

sangat otomatis dan sangat peka.

Ada dua fase HPLC:

Fase normal HPLC

Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar

misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan

mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih

lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh

karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non

polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara

sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar

digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan

molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan

sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam)

dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar

dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan

pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk

atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals.

Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan

pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada

dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-

senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam

kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui

kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat

seluruh proses

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan

bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi

tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah

mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju

detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu

dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang

maksimum dari senyawa itu.

Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk

beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari

pelarut)

Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada

ukuran partikel)

Komposisi yang tepat dari pelarut

Temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan

waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.

Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan

ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang

gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom

dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan

langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu

yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang

digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda,

senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda

dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan

air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air

sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar

dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-

masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan

menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat

menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang

diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa

murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur

kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam

senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang

telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu

retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari

senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui

detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area

dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun

waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan

untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah

kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi

yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah

relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV

sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area

dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi

dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit

dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap

lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

An HPLC. From left to right: A pumping device generating a gradient of two different solvents, a steel enforced column and an apparatus for measuring the absorbance.

Picture of an HPLC instrument

Gambar peralatan HPLC

DAFTAR PUSTAKA

R.A.Day dan Underwood.2002. Analisis kimia kuantitatif. Jakarta: Erlangga

Pecsok and LD Shields.1976. Modern Methods of Chemical Analysis.USA

www.wikipedia.org , diakses 1 maret 2010

Http://www.edu2000.org/portal/index. diakses 1 maret 2010

http://www.oc-praktikum.de/id/arKromatografi (HPLC).diakses 10 maret 2010

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromat.diakses 10

maret 2010