Post on 24-May-2019
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL SiHa
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Presti Arma Edytianingsih
NIM : 058114156
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2009
ii
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL SiHa
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Presti Arma Edytianingsih
NIM : 058114156
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2009
iii
iv
v
Kupersembahkan karya sederhanaku ini untuk :
Papa dan mamaku tercinta atas kasih sayang dan
do’anya
Adik Yurna yang tersayang
Sahabatku Eri
Kekasihku Satya
Orang-orang yang menyayangiku
Dan Almamaterku
vi
vii
PRAKATA
Atas berkat rakhmat Allah SWT dan karunia – Nya skripsi yang berjudul ”Uji
Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
terhadap Kultur Sel SiHa” ini dapat diselesaikan. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi
salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) pada Program Studi
Farmasi di Universitas Sanata Dharma.
Penulisan skripsi ini tidak mungkin terwujud tanpa adanya bimbingan, bantuan,
dan dukungan dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini, penulis mengucapkan
terima kasih kepada :
1. Ibu Rita Suhadi, M. Si, Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Renny Kusumastuti, M. P. sebagai dosen pembimbing yang telah
banyak meluangkan waktu, tenaga, dan atas segala masukan, bimbingan,
serta saran dalam penyusunan skripsi ini.
3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M. Si dan Ibu Dewi Setyaningsih, M. Sc, Apt
selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan
masukan dan saran, serta bimbingan dalam penyempurnaan skripsi ini.
4. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta, atas bantuan dan dukungannya selama ini.
5. Ibu Haryati, Mas Anif, Mbak Yuli, dan segenap karyawan LPPT UGM
Yogyakarta yang telah membantu pelaksanaan penelitian skripsi ini.
6. Papa, mama, dan adek Yurna yang tersayang, atas kasih sayang, do’a,
dukungan, motivasi, dan semangat selama ini.
viii
7. Satya ayangku, atas segala perhatian, cinta, pengertian, pengorbanan, do’a,
semangat, dan pendampinganmu selama skripsi ini dibuat.
8. Seluruh keluarga besarku, atas semangat dan do’a kalian sehingga
terselesaikan skripsi ini.
9. Sinta ‘Lele’, Erlin, Rini, terima kasih atas semua kebersamaan kita, duka
cita, dan bantuan sehingga penelitian dan skripsi kita terselesaikan dengan
lancar.
10. Sahabat-sahabatku tersayang, Eri ‘Kucing’ ,Ticha, Shinta, Ina, Rillya,
Pipit, terima kasih atas semangat serta ejekan-ejekan kalian yang
membuatku terpacu menyelesaikan semuanya, I love u so much all.
11. Teman-temanku, Mbak Nur, Mbak Nita, Mbak Agnes, Rizka, Chrisye, dan
semua teman angkatan 2005 atas semua semangat kalian.
12. Semua pihak yang telah membantu penyusunan skripsi ini yang tidak
dapat disebutkan satu persatu.
Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis
mengucapkan banyak terima kasih. Penulis juga menyadari sepenuhnya
bahwa penulisan skripsi ini tidak terlepas dari keterbatasan dan
kekurangan penulis. Oleh karena ini, diharapkan kritik dan saran yang
membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Besar harapan penulis
bahwa skripsi ini dapat bermanfaat bagi perbendaharaan dan
perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
ix
x
INTISARI
Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang ditakuti karena banyak
mengakibatkan kematian di seluruh dunia. Banyak studi telah dikembangkan untuk
memperoleh senyawa antikanker dari bahan alam, salah satunya yaitu daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui berapa
LC50 dari ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental eksploratif. Uji sitotoksisitas
dilakukan dengan memberi perlakuan terhadap sel SiHa dengan ekstrak heksan daun sirih
merah dengan kadar tertentu. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode
MTT dan direct counting (perhitungan langsung). Data yang diperoleh berupa persen
kematian sel dan harga LC50 yang kemudian diolah dengan analisis probit dan Z-test.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak heksan daun sirih merah bersifat
sitotoksik terhadap sel SiHa. Harga LC50 yang diperoleh dari ekstrak heksan daun sirih
merah dengan metode MTT sebesar 102,24 µg/ml dan dengan metode direct counting
sebesar 83,95 µg/ml. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa ekstrak heksan daun
sirih merah diperkirakan mengandung senyawa yang memiliki aktivitas anti kanker.
.
Kata kunci: daun sirih merah, kanker, sel SiHa, sitotoksisitas, LC50
xi
ABSTACT
Cancer is one of the most feared disease in the world because of its mortality
rates. There have been many studies and research to found an anti-cancer substance from
nature, and one of them are celebes pepper. The aim of this research is to find out LC50
value of the hexan extract of celebes pepper to the culture of SiHa cell.
This research took form of an experimental explority research. The cytotoxic
assay was conducted by giving the SiHa cell with hexan extract of celebes pepper in a
certain quantity. MTT method and direct counting method were used in this cytotoxic
assay. The result data, such as the cell mortality percentage and the LC50 value, then be
analyzed with probit analisys method and Z-test.
It was shown that hexan extract of celebes pepper have a cytotoxic form of
influence to the SiHa cell. The value of LC50 obtain from the hexan extract of celebes
pepper with MTT method is 102,24 µg/ml and with direct counting method is 83,95
µg/ml. With this results, it could be conclude that apparently hexan fraction of celebes
pepper have an anti-cancer substance.
Keys : celebes pepper leaves, cancer, SiHa cell, cytotoxicity, LC50 value
xii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................................. .. ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN .................................................................................. iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................... v
PRAKATA ............................................................................................................... vii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................... ix
INTISARI ................................................................................................................. x
ABSTRACT ............................................................................................................... xi
DAFTAR ISI ............................................................................................................ xii
DAFTAR TABEL .................................................................................................... xv
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ xvi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................ xvii
BAB I PENGANTAR ............................................................................................ 1
A. Latar Belakang ................................................................................................ 1
1. Permasalahan ........................................................................................ 3
2. Keaslian penelitian ................................................................................ 3
3. Manfaat penelitian ................................................................................ 3
B. Tujuan ............................................................................................................. 4
1. Tujuan umum .................................................................................... 4
2. Tujuan khusus .................................................................................... 4
xiii
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .................................................................... 5
A. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)............................. 5
1. Keterangan botani ................................................................................. 5
2. Sinonim ................................................................................................. 5
3. Deskripsi ............................................................................................... 5
4. Habitat .................................................................................................. 5
5. Kandungan kimia .................................................................................. 6
6. Khasiat dan penggunaan ....................................................................... 6
7. Penelitian tanaman sirih merah ............................................................. 6
B. Minyak atsiri ....................................................................................................... 7
C. Metode Penyarian ..................................................................................... 7
D. Kanker……………. .................................................................................. 8
1. Definisi ................................................................................................ 8
2. Kanker servix .............................................................................. 9
3. Sel SiHa ...................................................................................... 9
E. Uji Sitotoksisitas ....................................................................................... 9
1. Metode MTT ........................................................................................ 10
2. Metode direct counting ............................................................... 10
F. Landasan Teori ......................................................................................... 11
G. Hipotesis ................................................................................................... 12
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 13
A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................................... 13
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ......................................... 13
1. Variabel .................................................................................................... 13
2. Definisi operasional ................................................................................. 13
C. Alat dan Bahan ................................................................................................... 14
1. Alat .................................................................................................... 14
2. Bahan .................................................................................................... 14
D. Tata Cara Penelitian ........................................................................................... 15
xiv
1. Determinasi tanaman ............................................................................ 15
2. Pengumpulan daun sirih merah............................................................. 16
3. Pembuatan ekstrak heksan daun sirih merah ........................................ 16
4. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................... 16
5. Pembuatan larutan uji ........................................................................... 18
6. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah ............................... 18
E. Analisis Hasil ...................................................................................................... 20
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 22
A. Determinasi Tanaman ........................................................................................ 22
B. Pengumpulan Daun Sirih Merah ........................................................................ 22
C. Ekstraksi ............................................................................................................ 23
D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa .......................... 25
1. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa dengan metode
MTT..................................................................................... ..................... 25
2. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa dengan metode
direct counting....................................................................... ................... 27
E. Analisis hasil ...................................................................................................... 28
1. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa dengan metode
MTT...................................................................................... .................... 28
2. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa dengan metode
direct counting....................................................................... ................... 31
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 39
A. Kesimpulan ......................................................................................................... 39
B. Saran .................................................................................................................. 39
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 40
LAMPIRAN ............................................................................................................. 43
BIOGRAFI PENULIS ............................................................................................. 68
xv
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah........................ 24
Tabel II. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
berbagai konsentrasi dengan metode MTT..........................
29
Tabel III. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
dengan konsentrasi terpilih dengan metode MTT...............
30
Tabel IV. Data uji sitotoksisitas terhadap sel SiHa metode direct
counting.................................................................................
32
Tabel V. Data uji sitotoksisitas terhadap sel Vero metode direct
counting.
32
Tabel VI. Data % kematian sel SiHa dengan perlakuan ekstrak
heksan daun sirih merah........................................................
33
Tabel VII. Data % kematian sel Vero dengan perlakuan ekstrak
heksan daun sirih merah........................................................
34
Tabel VIII. Data analisis Z-test pada sel SiHa......................................... 36
Tabel IX. Data analisis Z-test pada sel Vero......................................... 36
xvi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Reaksi pembentukan formazan........................................... 26
Gambar 2. Sel SiHa yang mati (i) dan sel SiHa yang hidup (ii)
setelah pemberian trypan blue di bawah pengamat
mikroskop dengan perbesaran 100x....................................
27
Gambar 3. Kontrol sel SiHa (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah
pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x...............
28
Gambar 4. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan sirih merah
terhadap % kematian sel SiHa pada metode
MTT....................................................................................
29
Gambar 5. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan sirih merah
terhadap harga probit pada metode
MTT....................................................................................
31
Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah
terhadap probit pada sel SiHa pada metode direct
counting...............................................................................
33
Gambar 7. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah
terhadap harga probit pada sel Vero pada metode direct
counting...............................................................................
35
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Foto daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).........
43
Lampiran 2. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun
sirih merah terhadap sel SiHa dengan
metode MTT........................................................................
44
Lampiran 3. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan
daun sirih merah dengan
metode Direct Counting......................................................
46
Lampiran 4. Analisis Statistik Z-test Ekstrak Heksan Daun
Sirih Merah pada Metode Direct Counting.........................
54
Lampiran 5. Hasil uji KLT ekstrak heksan daun sirih merah..................
56
Lampiran 6. Foto alat-alat yang digunakan dalam penelitian..................
63
Lampiran 7. Harga probit sesuai dengan persentasenya..........................
66
Lampiran 8. Hasil Determinasi Tumbuhan 67
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kanker termasuk penyakit yang sangat ditakuti karena penyakit ini sulit
disembuhkan, bahkan bisa menyebabkan kematian. Kanker merupakan penyakit
yang disebabkan karena adanya sel abnormal.
Saat ini di Indonesia kanker telah menjadi masalah kesehatan
masyarakat yang besar, yang perlu ditanggulangi secara menyeluruh, terpadu,
efektif, efisien, dan ekonomis. Kanker dapat menyerang seluruh lapisan
masyarakat, walaupun yang terbanyak pada usia lanjut (Sukardja, 2000).
Carsinoma servix uteri merupakan jenis kanker ganas yang paling sering
diketemukan diantara kanker ginekologis. Sesuai dengan namanya carcinoma
servix uteri (kanker leher rahim) adalah kanker yang menyerang jaringan pada
servix uteri (leher rahim), suatu daerah pada organ reproduksi wanita yang
merupakan pintu masuk ke arah rahim.
Di negara-negara maju carcinoma servix uteri menempati urutan setelah
kanker payudara, kanker kolorektum, dan kanker endometrium. Sedangkan di
negara-negara sedang berkembang carcinoma servix uteri menempati urutan
pertama. Menurut data histopatologi Indonesia tahun 1988, dari semua jenis
kanker wanita, kanker servix menduduki urutan pertama (18,2%) (Swandarini,
1998). Sampai saat ini penyebab penyakit carcinoma servix uteri belum secara
pasti dapat diketahui, diduga banyak faktor yang berperan dalam proses
kejadiannya.
2
Banyak usaha yang telah dilakukan untuk menyembuhkan penyakit ini.
Umumnya, pengobatan kanker dilakukan dengan obat-obatan sintesis dan radiasi
tetapi terapi yang digunakan tersebut banyak menimbulkan efek samping yang
merugikan penderita. Oleh karena itu, kini banyak dilakukan penelitian-penelitian
untuk mencari alternatif pengobatan kanker terutama yang menggunakan bahan-
bahan alam (Ganiswara & Nafrialdi, 1995).
Salah satu bahan alam yang dapat digunakan untuk pengobatan kanker
servik ini adalah sirih merah. Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
merupakan salah satu tanaman yang memiliki berbagai khasiat. Secara empiris
dengan cara merebus daun sirih merah yang masih segar, daun sirih merah
digunakan untuk mengobati kanker, kencing manis, ambeien, peradangan,
hepatitis, maag, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit
sembuh, TBC, lemah sahwat, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat
(Sudewo, 2005).
Kemudian telah dilakukan uji sitotoksisitas terhadap sel SiHa (sel kanker
leher rahim) dengan ekstrak etanol daun sirih merah dan didapatkan kesimpulan
bahwa ekstrak etanol daun sirih merah memiliki efek sitotoksik dengan harga
LC50 sebesar 200,6 µg/ml (Nur’aniyah, 2008). Etanol merupakan penyari yang
bersifat polar sehingga menyari senyawa-senyawa polar pada daun sirih merah.
Selanjutnya pada penelitian ini digunakan penyari heksan yang bersifat non polar
untuk mengetahui apakah senyawa non polar, seperti minyak atsiri yang akan
tersari dari daun sirih merah tersebut juga memiliki efek sitotoksik terhadap sel
SiHa. Diduga senyawa monoterpen dan carvacrol pada minyak atsiri yang
3
terkandung dalam daun sirih merah memiliki aktivitas sebagai antikanker (Daris,
2008)
1. Perumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang ada maka dirumuskan
permasalahan sebagai berikut :
a. apakah ekstrak heksan daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik
terhadap kultur sel SiHa?
b. seberapa besar harga LC50 dari ekstrak heksan daun sirih merah terhadap
kultur sel SiHa?
2. Keaslian penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian
mengenai uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur
sel SiHa.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi
ilmiah dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat,
kegunaan, dan efek sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
terhadap kultur sel SiHa.
b. Manfaat praktis
Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai
pembuktian secara ilmiah penggunaan ekstrak heksan daun sirih merah
sebagai obat antikanker dari bahan alam.
4
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak heksan
daun sirih merah memiliki efek sitotoksik.
2. Tujuan khusus
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui seberapa besar harga
LC50 dari ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.
5
BAB II
PENELAAH PUSTAKA
A. Tanaman Sirih Merah
1. Keterangan botani
Familia : Piperaceae (suku sirih-sirihan)
Genus : Piper
Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav. (Anonim, 2008b)
2. Sinonim
Piper ornatum N. E. Br
3. Deskripsi
Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna
hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung
dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap
dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun
bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna
merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma
wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap
buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).
4. Habitat
Sirih merah tergolong langka karena tidak tumbuh di setiap tempat
atau daerah. Sirih merah tidak dapat tumbuh subur di daerah panas.
Sementara itu, di tempat berhawa dingin sirih merah dapat tumbuh dengan
6
baik. Tanaman sirih merah akan tumbuh dengan baik jika mendapatkan 60-
70% cahaya matahari (Sudewo, 2005).
5. Kandungan kimia
Berdasarkan penelitian yang dilakukan menunjukkan bahwa sirih
merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan
minyak atsiri (Sudewo, 2005).
6. Khasiat dan penggunaan
Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat
merangsang saraf pusat dan daya pikir. Daun sirih merah juga mampu
mengatasi penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ
tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, tifus,
leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag kronis, jantung
koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).
7. Penelitian tanaman sirih merah
Berdasarkan pemeriksaan menggunakan uji tabung dan KLT dapat
diketahui bahwa daun sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa
polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).
Penelitian yang lain adalah uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun
sirih merah terhadap sel SiHa menghasilkan harga LC50 sebesar 200,6 µg/ml
(Nur’aniyah, 2008), sel HeLa 1.143,1 µg/ml (Atmaningsih, 2008), sel Raji
395,5 µg/ml (Dwikusumaningtyas, 2008), sel T47D 587,7 µg/ml (Neritika,
2008), dan sel Myeloma 434,1 µg/ml (Meri, 2008). Berdasarkan penelitian-
7
penelitian di atas dapat diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah
memiliki efek sitotoksik.
B. Minyak Atsiri
Kandungan kimia lainnya yang terdapat di daun sirih merah adalah
minyak atsiri, seperti hidroksikavicol, kavi-col, kavibetol, allylprokatekol,
carvacrol, eugenol, p-cymene, cineole, caryofelen, kadimen estragol, ter-penena,
dan fenil propada (Anonim, 2008b).
Pada umumnya, minyak atsiri alami dapat dibagi menjadi dua kelompok
kimia konstituen, yaitu hydrocarbon yang terdiri dari terpen (monoterpen,
sesquiterpen, dan diterpen) dan komponen oxygenated yang terdiri dari ester,
aldehide, keton, alkohol, fenol, dan oxide (Anonim, 2009).
Carvacrol Cavicol Cineol
C. Metode Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan
yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Faktor yang dapat mempengaruhi
kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan
batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim,
1986).
8
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan
cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Prinsip perkolasi
adalah sebagai berikut:
Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang bagian
bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah
melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang
dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh
kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan daya
kapiler yang cenderung untuk menahan.
Alat yang digunakan untuk perkolasi adalah perkolator. Cairan yang
digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif
yang keluar dari perkolator disebut perkolat, sedang sisa setelah dilakukannya
penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).
D. Kanker
1. Definisi
Secara karakterisktik, kanker adalah populasi-populasi sel yang
mengalami pertumbuhan tak terkendali. Kanker cenderung menginvasi
struktur-struktur yang bersebelahan dan dapat mengganggu fungsi-fungsi
normal jaringan-jaringan yang mengelilinginya. Penyebaran menyeluruh dari
kanker dinamai metastatis (George, 1999). Kanker dapat menyerang berbagai
sel pada seluruh organ di dalam tubuh, dari kepala sampai ujung kaki
(Sinardi, 2000). Kanker terjadi karena pemaparan berulang-ulang oleh satu
9
atau lebih karsinogen yang memicu perubahan sel dan menginisiasi
transformasi menjadi sel ganas (Meleka, 1983).
2. Kanker cervix
Kanker servik (Cervical Cancer) merupakan kanker yang terjadi
pada servik uterus, suatu daerah pada organ reproduksi wanita yang
merupakan pintu masuk ke arah rahim yang terletak antara rahim (uterus)
dengan liang senggama (vagina) (Anonim, 2008a).
Kanker cervix kebanyakan terjadi sebagai squamosa carsinoma
yaitu sekitar 95% dan sedikit terjadi pada sel endocervical columnal sebagai
adenosquamosa carsinoma yaitu sekitar 5%. Faktor-faktor penyebab kanker
cervix antara lain berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-
ganti, perokok dan terpapar oleh Human Papilloma Virus (HPV) dan virus
herpes simplek II. Pada metastasis melalui sistem limfatik, jarang terjadi
metastasis yang jauh (King, 2000).
3. Sel SiHa
Sel SiHa adalah salah satu kanker cervix yang menyebabkan
kematian yang tinggi pada wanita. Sel SiHa diperoleh dari fragmen sampel
jaringan primer dari suatu carsinoma cervix dan merupakan squamosa yang
tidak terdiferensiasi. Morfologi sel SiHa mirip dengan sel epitelial dan sel ini
mengandung Human Papilloma Virus 16 (HPV-16) (Anonim, 2008c).
E. Uji Sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang
digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan,
10
pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik
dari suatu senyawa (Freshney, 1986).
Menurut National Institute of Health (NIH), senyawa antikanker
dikategorikan dalam lima klasifikasi berdasarkan nilai LC50. Klasifikasi tersebut
meliputi Kategori 1, senyawa antikanker dengan strongest LC50 = 190-528 µg/ml;
Kategori 2, senyawa antikanker dengan moderate to strong LC50 = 528-1197
µg/ml; Kategori 3, senyawa antikanker dengan moderate LC50 = 1259-2515
µg/ml; Kategori 4, senyawa antikanker dengan weak to moderate LC50 = 2528-
4939 µg/ml; dan Kategori 5, senyawa antikanker dengan weak LC50 > 5000
µg/ml (Mazzio,2009).
1. Metode MTT
Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel
pada uji sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada
metode MTT, garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazolium bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui
reaksi yang ada di mitokondria untuk membentuk formazan. Produk
formazan terakumulasi di sel karena tidak dapat menembus membran sel
(Barille, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur sampel
dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths, 2000).
2. Metode Direct Counting
Metode yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang
akurat dan efisien adalah dengan menggunakan haemocytometer. Dalam
metode ini digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan
11
persegi untuk mempermudah penghitungan. Menggunakan zat warna seperti
trypan blue, penghitungan sel yang hidup dan sel yang tidak hidup dapat
dilakukan. Sampling yang akurat, pengenceran dan pengisian bilik secara
tepat sangat penting. Pengisian yang berlebihan, adanya gelembung udara dan
bilik hitung yang kurang bersih menyebabkan kesalahan penghitungan.
Kesalahan statistik dapat dikurangi dengan menghitung cukup sel dengan
replikasi yang tetap. Penghitungan dengan haemocytometer adalah metode
yang paling sederhana dan versatile dengan keuntungan yaitu memberikan
pengukuran langsung (aktual sel) (Doyle and Griffiths, 2000).
F. Landasan Teori
Penelitian terhadap daun sirih merah yang merupakan salah satu
tanaman yang diketahui secara empiris memiliki khasiat untuk mengobati kanker
menjadi sangat menarik dilakukan untuk menemukan alternatif lain dalam
pengobatan kanker terutama yang menggunakan bahan-bahan alam (back to
nature).
Penelitian terhadap ekstrak etanol daun sirih merah telah membuktikan
bahwa senyawa polar dari daun sirih merah memiliki potensi sebagai antikanker.
Dan penelitian terhadap ekstrak heksan daun sirih merah diharapkan akan
menambah pengetahuan tentang khasiat senyawa non polar daun sirih merah
sebagai antikanker seperti minyak atsiri.
Metode perkolasi diketahui efektif untuk mengekstrak suatu tanaman
sehingga seluruh zat aktif pada tanaman tersari dengan sempurna. Pelarut heksan
12
akan melarutkan zat aktif yang bersifat non polar yang terkandung dalam daun
sirih merah tersebut.
G. Hipotesis
Ekstrak heksan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) dapat
memberikan efek sitotoksik pada sel SiHa.
13
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian tentang sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian
eksperimental eksploratif.
B. Variable dan Definisi Operasional
1. Variabel
a. Variabel bebas
Kadar ekstrak heksan daun sirih merah (µg/ml).
b. Variabel tergantung
Persentase kematian sel SiHa.
c. Variabel pengacau terkendali
1) Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan
dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.
2) Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium
RPMI 1640-serum.
3) Kematian alami sel dapat dikendalikan dengan kontrol dan pemberian
nutrisi.
2. Definisi Operasional
a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak heksan daun sirih
merah terhadap kultur sel SiHa.
b. Daun sirih merah adalah helain daun (lamina) dari daun sirih merah.
14
c. Ekstrak heksan adalah hasil perkolasi serbuk daun sirih merah dengan
penyari heksan.
d. Sel SiHa adalah kultur sel kanker cervix yang menyebabkan kematian
yang tinggi pada wanita dan mengandung Human Papilloma Virus 16
(HPV-16).
e. LC50 ialah konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah yang mampu
membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel SiHa dan
dinyatakan dalam µg/ml.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat
gelas, perkolator, autoklaf, alumunium foil, kertas saring, Waterbath, Oven,
inkubator CO2 (Memmer), timbangan analitik (Denver Instrument XL-610),
tissue, glove, masker, yellow tips, blue tips, effendorf, tabung conical (Nunc),
tissue culture flask (Nunc), swing rotor sentrifuge, mikropipet, membran
dialisis (Sigma), lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well plate
(Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2),
haemocytometer (Neubauer), ELISA reader.
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain :
a. Bahan utama : daun sirih merah segar
b. Bahan untuk ekstraksi : heksan
15
c. Uji sitotoksisitas :
1) Kultur sel SiHa dan sel Vero yang diperoleh dari stok Laboratorium
Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
2) Medium pencuci sel : RPMI 1640 (Gibco), Natrium bikarbonat, dan
hepes.
3) Medium penumbuh sel : RPMI 1640 (Gibco), FBS (Fetal Bovine
Serum) 10 %, Penisilin-Streptomisin 1 % (Gibco), Fungison 0,5 %
(Gibco), M199
4) Pewarna Trypan blue (Sigma)
5) DMSO (Dimetil Sulfoksida)
6) Reagen Stopper : SDS (sodium dodesil sulfat) dalam HCl 0,01 N
(Merck)
7) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)
(Sigma)
8) Tripsin 0,5 %
9) Aquabidest
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Tanaman
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun sirih
merah segar, yang telah dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi,
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
16
2. Pengumpulan daun sirih merah
Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman
sirih merah di Dusun Ngangkrik, Sleman, Yogyakarta.
3. Pembuatan ekstrak daun sirih merah
a. Pembuatan serbuk
Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci
dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat,
kemudian dipotong kecil-kecil dan ditiriskan sampai sisa-sisa air
menghilang. Selanjutnya daun dikeringkan dalam lemari pengering
dengan suhu 50⁰ C. Setelah kering, daun diserbuk menggunakan mesin
penyerbuk.
b. Pembuatan ekstrak heksan daun sirih merah
Memasukkan 100 gram serbuk daun sirih merah ke dalam
perkolator. Rendam dengan penyari heksan 400 ml selama 24 jam.
Kemudian teteskan penyari heksan sampai habis, tambahkan lagi penyari
heksan dan teteskan sampai tetesan menjadi bening. Ekstrak heksan yang
dihasilkan didestilasi menggunakan evaporator kemudian diuapkan
dengan pemanasan di bawah 50oC sehingga didapatkan ekstrak kental
daun sirih merah.
4. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
a. Identifikasi minyak atsiri (cineol, caryophylen, cavicol, carvacrol)
Mengambil ekstrak heksan daun sirih merah dilarutkan dalam
heksan (50 mg/ml) lalu di vortex. Kemudian totolkan ekstrak heksan
17
daun sirih merah dan pembanding cineol, caryophylen, cavicol, dan
carvacrol pada silika GF 254, masukkan ke dalam chamber berisi fase
gerak toluene : etil asetat (93 : 7). Elusi ditunggu hingga batas (10 cm)
kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditunggu hingga kering. Deteksi
bercaknya dengan cara menyemprot asam sufat dan vanillin kemudian
panaskan di atas kompor listrik hingga terlihat warnanya.
b. Identifikasi tannin
Mengambil ekstrak heksan daun sirih merah dilarutkan dalam
heksan (50 mg/ml) lalu di vortex. Kemudian totolkan ekstrak heksan
daun sirih merah dan pembanding tannin pada silika GF 254, masukkan
ke dalam chamber berisi fase gerak butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5).
Elusi ditunggu hingga batas (10 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber
dan ditunggu hingga kering. Deteksi bercaknya dengan cara menyemprot
reagen FeCl3.
c. Identifikasi flavonoid
Mengambil ekstrak heksan daun sirih merah dilarutkan dalam
heksan (50 mg/ml) lalu di vortex. Kemudian totolkan ekstrak heksan
daun sirih merah dan pembanding rutin pada selulosa, masukkan ke
dalam chamber berisi fase gerak etil asetat : asam asetat : asam formiat :
air (100:11:11:27). Elusi ditunggu hingga batas (10 cm) kemudian
dikeluarkan dari chamber dan ditunggu hingga kering. Deteksi bercaknya
dengan uap amonia.
18
d. Identifikasi alkaloid
Mengambil ekstrak heksan daun sirih merah dilarutkan dalam
heksan (50 mg/ml) lalu di vortex. Kemudian totolkan ekstrak heksan
daun sirih merah dan pembanding kinin pada selulosa, masukkan ke
dalam chamber berisi fase gerak metanol : amonia (100:1,5). Elusi
ditunggu hingga batas (10 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan
ditunggu hingga kering. Deteksi bercaknya dengan cara menyemprot
reagen dragendorff.
5. Pembuatan larutan uji
Membuat sediaan ekstrak induk dengan menimbang ekstrak kental
100 mg lalu dilarutkan dengan pelarut DMSO 200 µl dan diaduk sampai
larut, kemudian ditambahkan RPMI 800 µl. Dari sediaan ekstrak induk
tersebut dibuat sediaan uji dengan konsentrasi ekstrak heksan daun sirih
merah yang diinginkan.
6. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
a. Panen sel SiHa
Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari),
media diganti dengan RPMI baru, sel siha menempel di dinding flask
sehingga harus dilepaskan dengan cara menambahkan tripsin kemudian
diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam
tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10
ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan
pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian
19
dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah
medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,0x104 sel/100 µl
dan siap dipakai untuk penelitian lebih lanjut.
b. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan
kepadatan 2x104/100 µl dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate.
Masukkan ekstrak uji dengan konsentrasi masing-masing ke dalam
sumuran dan setiap konsentrasi direplikasi sebanyak 3 kali. Untuk
kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh.
Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC,
dalam inkubator dengan aliran 5% CO2.
Setelah diinkubasi, medium RPMI diganti dengan yang baru
sebanyak 200 µl, kemudian ke dalam masing-masing sumuran
ditambahkan 10 µl MTT 5 µg/ml, lalu diinkubasikan 3,5 jam pada suhu
37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2. Sel hidup akan bereaksi
dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan
menambahkan 100 µl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi
semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan
ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan
berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Dilakukan replikasi
sebanyak 3 kali.
20
c. Uji sitotoksisitas dengan metode direct counting
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan
kepadatan 2x104/100 µl dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate.
Masukkan ekstrak uji dengan konsentrasi masing-masing ke dalam
sumuran dan setiap konsentrasi direplikasi sebanyak 3 kali. Untuk
kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh.
Selanjutnya plate diinkubasi dalam inkubator dengan aliran 5% CO2
selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, medium tiap sumuran
diambil diganti dengan tripsin, kemudian diresuspensi dan ditambah 50
µl Trypan blue, diresuspensi lagi untuk homogenisasi diambil 10 µl
untuk pengamatan. Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap
dihitung dengan counter dibawah mikroskop. Dilakukan replikasi
sebanyak 3 kali. Metode ini juga dilakukan pada sel Vero.
E. Analisis hasil
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode MTT dan direct
counting. Pada metode MTT, serapan akan terbaca serta menunjukkan jumlah sel
yang hidup dan hasil akhir uji sitotoksisitas yaitu persentase kematian sel yang
dihitung menggunakan modifikasi rumus Abbot, dengan rumus berikut:
%100% xA
BAselkematian
−=
Keterangan :
A = Rata-rata absorbansi kelompok kontrol negatif
B = Rata-rata absorbansi kelompok perlakuan
21
Sedangkan pada metode direct counting. Harga persentase kematian dapat
ditentukan dengan menghitung jumlah sel hidup ditambah jumlah sel hidup
dikurangi jumlah sel hidup, kemudian dibagi dengan jumlah sel hidup ditambah
jumlah sel mati dikalikan 100%.
% Kematian sel = ��������������� ���������������
�������������� ��� ��� x 100%
Untuk menghitung harga LC50 menggunakan analisis probit (Mursyidi,
1985). Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi untuk mengetahui
hubungan konsentrasi-respon (persen kematian sel) agar diperoleh persamaan
garis lurus sehingga dapat digunakan untuk menentukan LC50. Sedangkan untuk
menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan data
dengan statistik Z-test.
22
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman
sebelum digunakan dalam suatu penelitian. Determinasi tanaman dilakukan di
Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta. Hasil yang diperoleh dari determinasi menyatakan bahwa tanaman
yang digunakan dalam penelitian adalah benar tanaman sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav).
B. Pengumpulan daun sirih merah
Penelitian ini menggunakan daun dari tanaman sirih merah yang dipetik
dari pekarangan rumah warga di Dusun Ngangkrik, Sleman, Yogyakarta.
Pengambilan daun sirih merah hanya dari satu pohon dan sekali panen dengan
tujuan meminimalkan variasi kandungan kimia. Dipilih daun yang tidak terlalu
muda dan tidak terlalu tua agar didapat kandungan senyawa aktif yang optimal.
Setelah dipetik, daun sirih merah dicuci dengan air mengalir untuk
menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel pada permukaan daun, seperti
tanah, debu, serangga, dan lain-lain. Kemudian daun dipotong kecil-kecil dan
dikeringkan. Daun dipotong kecil-kecil untuk mempersempit lebar daun sehingga
cepat kering. Sedangkan pengeringan adalah untuk mengurangi kandungan air
yang terdapat dalam sampel. Pengeringan menggunakan lemari pengering dengan
suhu 50 ⁰C selama 24 jam. Daun dinilai sudah kering apabila mudah dipatahkan
atau diremuk. Selanjutnya dilakukan penyerbukan daun sirih merah menggunakan
23
mesin penyerbuk. Dalam bentuk serbuk, luas permukaan partikel yang dapat
kontak dengan cairan penyari menjadi lebih besar sehingga kandungan kimia
dapat tersari secara maksimal.
C. Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan dengan metode perkolasi menggunakan alat
perkolator dengan larutan penyari heksan. Prinsip metode ini adalah mengalirkan
cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi secara berulang-ulang
sampai perkolat menjadi bening. Bening disini diperkirakan bahwa semua
senyawa dalam daun sirih merah sudah tersari seluruhnya.
Serbuk simplisia dibasahi dengan cara direndam selama 24 jam,
perendaman serbuk ini dimaksudkan agar susunan sel serbuk akan dapat larut
dalam cairan penyari, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke
dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, dengan adanya perbedaan
konsentrasi zat aktif di dalam dan di luar sel, sehingga menyebabkan zat aktif di
dalam sel terdesak ke luar sel. Sisa perkolasi harus sampai bening, apabila belum
bening ditambahkan cairan penyari lagi dan dialirkan sampai benar-benar bening
sehingga zat aktif tersari sempurna.
Ekstrak yang diperoleh dievaporasi menggunakan vaccum rotary
evaporator agar didapat ekstrak pekat. Proses evaporasi bertujuan untuk
menguapkan pelarut dari ekstrak tersebut sehingga didapat ekstrak yang pekat.
Vaccum rotary evaporator menguapkan pelarut pada tekanan rendah dan suhu di
bawah titik didih sehingga tidak akan merusak senyawa dalam ekstrak. Ekstrak
pekat yang diperoleh disimpan dalam vial.
24
Cairan penyari yang digunakan adalah heksan karena heksan pelarut non
polar yang akan menyari senyawa-senyawa non polar yang ada pada daun sirih
merah. Pemilihan penyari heksan disini juga untuk mengetahui potensi sitotoksik
senyawa non polar pada daun sirih merah. Selain itu, heksan juga memiliki titik
didih rendah yaitu 69⁰C sehingga tidak diperlukan pemanasan tinggi untuk
menguapkannya. Senyawa-senyawa non polar yang kemungkinan akan tersari
dari daun sirih merah tersebut adalah minyak atsiri, yang terdiri dari monoterpen,
sesquiterpen dan senyawa fenolik. Untuk mengetahui kebenarannya maka dibuat
profil kromatografi lapis tipis (KLT) dari ekstrak daun sirih merah ini.
Tabel II. Profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah
Uji Baku
pembanding
Hasil
Minyak
atsiri
Cineol +
Caryophylen -
Cavicol -
Carvacrol -
Alkaloid Kinin -
Tanin -
Flavonoid Rutin -
Pada hasil profil KLT di atas menyatakan bahwa ekstrak heksan daun sirih
merah positif mengandung minyak atsiri jenis cineol, sedangkan jenis minyak
atsiri yang lain yaitu caryophylen, cavicol, carvacrol hasilnya negatif. Hal ini
mungkin disebabkan karena kadarnya di dalam ekstrak heksan daun sirih merah
sangat kecil sehingga tidak dapat terdeteksi menggunakan KLT. Untuk senyawa
alkaloid dan flavonoid juga negatif karena senyawa tersebut bersifat polar
sehingga tidak tersari dengan penyari heksan yang non polar.
25
KLT memang memiliki sensitifitas yang rendah dengan batas deteksi 0,1-
0,01 µg, sehingga sulit mendeteksi senyawa dengan kadar yang kecil. Untuk
mendeteksi senyawa dengan kadar yang kecil mungkin bisa digunakan
kromatografi gas yang lebih sensitif dengan batas deteksi 0,1-0,01 ng
(Wijesekera, 1991). Kromatografi ini juga sesuai untuk mendeteksi senyawa
seperti minyak atsiri yang mudah menguap.
D. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak
daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. Dengan uji ini dapat diketahui harga
LC50 (Lethal Concentration 50%) ekstrak daun sirih merah, yaitu konsentrasi
ekstrak daun sirih merah yang mampu mematikan 50% dari populasi kultur sel
SiHa. Pada penelitian ini, digunakan 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol dan
kelompok perlakuan. Kelompok kontrol adalah sel SiHa tanpa perlakuan ekstrak
heksan daun sirih merah, sedangkan kelompok perlakuan adalah sel SiHa dengan
perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah. Masing-masing kelompok dilakukan
replikasi sebanyak 3 kali.
1. Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode MTT
Metode uji sitotoksisitas yang mulanya digunakan adalah metode
MTT, karena metode ini menggunakan ELIZA reader untuk pembacaan
absorbansinya sehingga akurasinya tinggi. Absorbansi yang terbaca
sebanding dengan jumlah sel yang masih hidup. Selain itu metode ini juga
aman, sederhana, dan cepat. Aman karena tidak menggunakan bahan-bahan
berbahaya, sederhana karena perlakuan terhadap sampel relatif mudah, serta
cepat karena hanya memerlukan waktu beberapa menit untuk menguji sampel
yang jumlahnya banyak.
Prinsip metode MTT adalah terjadinya reduksi garam tetrazolium
MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl
merupakan garam larut air
sel metabolik aktif yang terdapat di mitokondria sel sehingga terbentuk
formazan berwarna ungu.
MTT (kuning)
Gambar
Intensitas warna yang terbentuk dibaca absorbansinya menggunakan
ELIZA reader pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang
terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang
absorbansi berarti semakin banyak sel yang hidup, dan sebaliknya, semakin
kecil absorbansi berarti semakin sedikit sel yang hidup.
sel yang hidup masih memiliki enzim yang beraktivitas untuk mereduksi
MTT menjadi kristal formazan yang berwarna ungu.
cepat karena hanya memerlukan waktu beberapa menit untuk menguji sampel
yang jumlahnya banyak.
Prinsip metode MTT adalah terjadinya reduksi garam tetrazolium
dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) yang
erupakan garam larut air berwarna kuning oleh enzim dehidrogenase pada
sel metabolik aktif yang terdapat di mitokondria sel sehingga terbentuk
formazan berwarna ungu.
MTT (kuning) fomazan (ungu)
Gambar 1. Reaksi pembentukan formazan
Intensitas warna yang terbentuk dibaca absorbansinya menggunakan
pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang
terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar
absorbansi berarti semakin banyak sel yang hidup, dan sebaliknya, semakin
kecil absorbansi berarti semakin sedikit sel yang hidup. Hal itu dikarenakan
sel yang hidup masih memiliki enzim yang beraktivitas untuk mereduksi
istal formazan yang berwarna ungu.
26
cepat karena hanya memerlukan waktu beberapa menit untuk menguji sampel
Prinsip metode MTT adalah terjadinya reduksi garam tetrazolium
diphenyltetrazolium bromide) yang
berwarna kuning oleh enzim dehidrogenase pada
sel metabolik aktif yang terdapat di mitokondria sel sehingga terbentuk
fomazan (ungu)
Intensitas warna yang terbentuk dibaca absorbansinya menggunakan
pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang
hidup. Semakin besar
absorbansi berarti semakin banyak sel yang hidup, dan sebaliknya, semakin
Hal itu dikarenakan
sel yang hidup masih memiliki enzim yang beraktivitas untuk mereduksi
27
2. Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode Direct
Counting
Metode direct counting yaitu metode yang dilakukan dengan
menghitung langsung jumlah sel hidup dan sel mati menggunakan mikroskop
dengan bantuan haemocytometer. Metode ini disebut juga metode Trypan
Blue karena menggunakan trypan blue untuk mewarnai kultur sel. Sel yang
mati telah kehilangan integritas membrannya sehingga sel mati akan
menyerap reagen dan berwarna biru, sedangkan sel hidup akan tetap bening
dan bercahaya karena masih memilki sitoplasma yang utuh.
Gambar 2. Sel SiHa yang mati (i) dan sel SiHa yang hidup (ii) setelah
pemberian trypan blue di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran
100x
Kelebihan metode ini adalah sederhana, mudah dilakukan, dan
ekonomis. Kelemahan dari metode ini adalah membutuhkan waktu yang lama
dan subjektivitasnya tinggi. Oleh karena itu, dilakukan penetapan sebanyak
tiga kali. Trypan blue ditambahkan di sumuran tidak secara serempak tetapi
satu per satu sesaat sebelum penghitungan kultur sel karena trypan blue juga
bisa diserap oleh sel hidup bila sel hidup terpapar terlalu lama.
(i)
(ii)
Uji sitotoksisitas
sel vero. Sel vero merupakan sel normal dari ginjal ker
untuk mengetahui apakah
potensi membunuh sel normal atau tidak.
(i)
Gambar 3. Kontrol sel SiHa (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah
pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x
1. Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode MTT
Nilai absorba
merah dengan metode MTT dari perlakuan dan kontrol pada masing
konsentrasi ekstrak daun sirih merah adalah sebagai berikut :
Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah juga dilakukan pada
sel vero. Sel vero merupakan sel normal dari ginjal kera. Hal ini bertujuan
untuk mengetahui apakah ekstrak heksan daun sirih merah mempunyai
potensi membunuh sel normal atau tidak.
(ii)
Kontrol sel SiHa (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah
pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x
E. Analisis hasil
Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode MTT
Nilai absorbansi hasil uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih
dengan metode MTT dari perlakuan dan kontrol pada masing
konsentrasi ekstrak daun sirih merah adalah sebagai berikut :
28
heksan daun sirih merah juga dilakukan pada
a. Hal ini bertujuan
heksan daun sirih merah mempunyai
Kontrol sel SiHa (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah
pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x
Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode MTT
ekstrak heksan daun sirih
dengan metode MTT dari perlakuan dan kontrol pada masing-masing
29
Tabel III. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
semua konsentrasi dengan metode MTT
Gambar 4. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan sirih merah
terhadap % kematian sel SiHa pada metode MTT
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-2 -1 0 1 2 3 4
% kem
atian
Log konsentrasi
Log konsentrasi vs %kematian (MTT)
Konsentrasi
ekstrak heksan
daun sirih
merah (µg/ml)
Absorbansi Rata-rata
absorbansi
%
kematian
sel SiHa Penetapan
I
Penetapan
II
Penetapan
III
2000 0,407 0,395 0,384 0,395 71,15
1000 0,384 0,375 0,380 0,380 72,24
500 0,350 0,344 0,344 0,346 74,73
250 0,423 0,406 0,423 0,417 69,54
125 0,792 0,732 0,724 0,749 45,29
62,5 0,937 0,941 0,974 0,951 30,53
31,25 0,916 0,962 0,974 0,951 30,53
15,625 0,985 0,989 1,001 0,992 27,54
7,813 1,009 1,016 1,033 1,019 25,57
3,906 1,019 0,986 1,008 1,004 26,66
1,953 0,932 0,952 0,983 0,956 30,17
0,977 0,974 0,944 1,004 0,974 28,85
0,488 0,991 1,001 0,986 0,993 27,47
0,244 0,978 0,995 0,987 0,987 27,90
0,122 0,964 0,932 0,981 0,959 29,95
kontrol 1,178 1,474 1,454 1,369
30
Tabel II merupakan data % kematian sel SiHa dari semua konsentrasi
yang digunakan dalam uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
dengan metode MTT. Dari tabel tersebut didapatkan kurva log konsentrasi
ekstrak heksan daun sirih merah terhadap % kematian (Gambar 4). Kemudian
untuk mendapatkan harga LC50 dilakukan penghitungan menggunakan
analisis probit (Mursyidi, 1985), yaitu dengan membuat persamaan regresi
linier antara log konsentrasi dengan nilai probit dari persen kematian, dan
dipilih titik dari konsentrasi 3,906 sampai 1000 µg/ml (Tabel III).
Tabel IV. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
dengan konsentrasi terpilih dengan metode MTT
Konsentrasi
ekstrak
heksan daun
sirih merah
(µg/ml)
Rata-rata
absorbansi
%
kematian
sel SiHa
Log
konsentrasi
Harga
probit
1000 0,380 72,24 3 5,58
500 0,346 74,73 2,69 5,67
250 0,417 69,54 2,39 5,52
125 0,749 45,29 2,09 4,87
62,5 0,951 30,53 1,79 4,5
31,25 0,951 30,53 1,49 4,5
15,625 0,992 27,54 1,19 4,42
7,813 1,019 25,57 0,89 4,36
3,906 1,004 26,66 0,59 4,39
31
Gambar 5. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan sirih merah
terhadap harga probit pada metode MTT
Dari data tersebut didapatkan persamaan y = 0,623x + 3,748 (Gambar
5) dan diperoleh harga LC50 pada sel SiHa dengan metode MTT sebesar
102,24 µg/ml.
Dilihat dari % kematian sel pada beberapa konsentrasi tidak
menunjukkan semakin tinggi kosentrasi semakin kecil absorbansi yang
terbaca karena banyak sel yang mati, hal ini kemungkinan dikarenakan oleh
ekstrak itu sendiri. Dalam hal ini, kurang dikendalikannya kriteria pemilihan
daun sirih merah saat pemanenan dan juga proses pembuatan ekstrak daun
sirih merah itu sendiri yang kurang sesuai.
2. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan Metode Direct
Counting
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih
merah terhadap sel SiHa dan sel Vero menggunakan metode direct counting
adalah jumlah sel hidup dan jumlah sel mati baik pada perlakuan atau kontrol.
y = 0,623x + 3,748
R² = 0,834
0
1
2
3
4
5
6
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
harga probit
Log konsentrasi
Log konsentrasi vs harga probit
32
Pada uji sitotoksisitas terhadap sel SiHa dibuat delapan konsentrasi ekstrak
daun sirih merah, yaitu 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, dan 25 µg/ml.
Sedangkan pada uji sitotoksisitas terhadap sel vero dibuat juga delapan
konsentrasi ekstrak daun sirih merah, yaitu 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200,
dan 100 µg/ml.
Tabel V. Data uji sitotoksisitas terhadap sel SiHa metode direct counting
Konsentrasi
ekstrak
heksan daun
sirih merah
(µg/ml)
Sel SiHa
Penetapan I Penetapan II Penetapan III
Hidup
Mati
Hidup
Mati
Hidup
Mati
300 0 41 0 40 0 41
250 5 37 5 38 5 37
200 14 30 13 31 14 30
150 20 28 20 28 21 28
100 26 26 26 26 26 26
75 31 23 32 23 33 22
50 39 19 38 20 39 19
25 47 17 45 16 46 17
kontrol 76 0 76 0 76 0
Tabel VI. Data uji sitotoksisitas terhadap sel Vero metode direct counting
Konsentrasi
ekstrak
heksan daun
sirih merah
(µg/ml)
Sel Vero
Penetapan I Penetapan II Penetapan III
Hidup
Mati
Hidup
Mati
Hidup
Mati
800 0 42 0 42 0 43
700 5 37 6 37 6 37
600 13 34 13 33 13 33
500 19 30 18 30 18 30
400 26 26 26 26 26 26
300 31 23 32 23 33 23
200 37 20 8 20 38 20
100 44 18 45 18 46 17
kontrol 75 0 75 0 75 0
33
Dari kedua tabel di atas menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol
baik sel SiHa maupun sel Vero tidak terjadi kematian sel. Hal itu berarti
kematian pada kelompok perlakuan memang disebabkan oleh ekstrak heksan
daun sirih merah itu sendiri. Dari data kematian sel di atas dapat dihitung %
kematian sel oleh ekstrak daun sirih merah.
Tabel VII. Data % kematian sel SiHa dengan perlakuan ekstrak heksan
daun sirih merah konsentrasi
ekstrak
heksan
(µg/ml)
Persen kematian sel SiHa (%) Probit
Penetapan I Penetapan II Penetapan
III
Rata-rata
300 100 100 100 100
250 88,0952 88,3721 88,0952 88,1875 6,18
200 68,1818 70,4545 68,1818 68,9394 5,50
150 58,3333 58,3333 57,1429 57,9365 5,20
100 50 50 50 50 5
75 42,5926 41,8182 40 41,4703 4,80
50 32,7586 34,4828 32,7586 33,3333 4,56
25 26,5625 26,2295 26,9841 26,5920 4,39
Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap
harga probit pada sel SiHa pada metode direct counting
y = 1,603x + 1,916
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Harga probit
Log konsentrasi
Log konsentrasi vs harga probit (Sel SiHa)
Tabel VIII. Data % kematian sel Vero dengan perlakuan
konsentrasi
ekstrak
heksan
(µg/ml)
Penetapan I
800 100
700 88,0952
600 72,3404
500 61,2245
400 50
300 42,5926
200 35,0877
100 29,0323
Gambar 7. Kurva log konsentrasi
Dilihat tabel data di atas, semakin tinggi konsentrasi semakin besar
persen kematian sel, itu berarti semakin tinggi konsentrasi semakin toksik
ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel. Untuk men
dibuat persamaan regresi linier
. Data % kematian sel Vero dengan perlakuan ekstrak
daun sirih merah
Persen kematian sel Vero (%)
Penetapan I Penetapan II Penetapan III Rata
100 100 100
0952 86,0465 86,0465 86,7294
72,3404 71,7391 71,7391 71,9395
61,2245 62,5 62,5 62,0748
50 50
42,5926 41,8182 41,0714 41,8274
35,0877 34,4828 34,4828 34,6844
29,0323 28,5714 26,9841 28,1959
log konsentrasi ekstrak daun sirih merah terhadap
probit pada sel Vero
Dilihat tabel data di atas, semakin tinggi konsentrasi semakin besar
persen kematian sel, itu berarti semakin tinggi konsentrasi semakin toksik
heksan daun sirih merah terhadap sel. Untuk mendapatkan
buat persamaan regresi linier antara log konsentrasi dengan nilai probit dari
34
ekstrak heksan
Probit
Rata-rata
100
86,7294 6,13
71,9395 5,58
62,0748 5,31
50 5
41,8274 4,80
34,6844 4,61
28,1959 4,42
terhadap harga
Dilihat tabel data di atas, semakin tinggi konsentrasi semakin besar
persen kematian sel, itu berarti semakin tinggi konsentrasi semakin toksik
dapatkan harga LC50
antara log konsentrasi dengan nilai probit dari
35
persen kematian. Dari hasil pengolahan data, diperoleh harga LC50 pada sel
SiHa dengan metode direct counting sebesar 83,95 µg/ml dan harga LC50 pada
sel Vero sebesar 290,40 µg/ml.
Menurut National Institute of Health (NIH), senyawa antikanker
dikategorikan dalam lima klasifikasi berdasarkan nilai LC50. Klasifikasi
tersebut meliputi Kategori 1, senyawa antikanker dengan strongest LC50 = 190-
528 µg/ml; Kategori 2, senyawa antikanker dengan moderate to strong LC50 =
528-1197 µg/ml; Kategori 3, senyawa antikanker dengan moderate LC50 =
1259-2515 µg/ml; Kategori 4, senyawa antikanker dengan weak to moderate
LC50 = 2528-4939 µg/ml; dan Kategori 5, senyawa antikanker dengan weak
LC50 > 5000 µg/ml (Mazzio,2009), baik dengan metode MTT atau direct
counting dapat dilihat bahwa ekstrak heksan daun sirih merah ini sangatlah
toksik karena nilai LC50 < 190 µg/ml, lebih kecil dari range nilai LC50 pada
kategori 1 (190-528 µg/ml). Sebaiknya dilakukan uji sitotoksik ekstrak heksan
daun sirih merah lebih lanjut menggunakan metode yang berbeda, dan untuk
lebih memastikan kebenarannya digunakan minimal 3 metode uji sitotoksisitas.
Dalam penelitian ini sebenarnya peneliti ingin mengetahui apakah
ekstrak heksan daun sirih merah tersebut aman untuk sel normal atau tidak,
akan tetapi di laboratorium tidak tersedia sel normal dari manusia sehingga
digunakan sel Vero yang merupakan sel normal dari ginjal kera. Karena sel
SiHa diambil dari leher rahim (cervix) manusia, maka data LC50 yang
diperoleh tidak dapat dibandingkan. Hal ini dikarenakan sel SiHa dengan sel
Vero berasal dari organ dan spesies yang berbeda, itu berarti keduanya
36
memiliki karakteristik yang berbeda pula sehingga responnya terhadap ekstrak
pun akan berbeda.
Tabel IX. Data analisis Z-test pada sel SiHa
Konsentra
si
(µg/ml)
Rata-rata sel
SiHa
Proporsi
sel mati
perlakuan
(P1)
Proporsi
sel mati
kontrol
(P2)
P0
Z
hitung
kesimpulan
hidup
mati
300 0 41 1
0
0,35 10,85 Berbeda bermakna
250 5 37 0,88 0,31 14,09 Berbeda bermakna
200 14 30 0,68 0,25 8,25 Berbeda bermakna
150 20 28 0,58 0,23 7,49 Berbeda bermakna
100 26 26 0,50 0,20 6,93 Berbeda bermakna
75 32 23 0,42 0,18 6,13 Berbeda bermakna
50 39 19 0,33 0,14 5,43 Berbeda bermakna
25 46 17 0,27 0,12 4,85 Berbeda bermakna
KONTROL 76 0
Tabel X. Data analisis Z-test pada sel Vero
Konsentra
si
(µg/ml)
Rata-rata sel
Vero
Proporsi
sel mati
perlakuan
(P1)
Proporsi
sel mati
kontrol
(P2)
P0
Z
hitung
kesimpulan
hidup
mati
800 0 42 1
0
0,36 10,85 Berbeda bermakna
700 6 37 0,86 0,31 9,68 Berbeda bermakna
600 13 33 0,72 0,27 8,67 Berbeda bermakna
500 18 30 0,63 0,24 8,00 Berbeda bermakna
400 26 26 0,5 0,20 6,93 Berbeda bermakna
300 32 23 0,42 0,18 6,13 Berbeda bermakna
200 38 20 0,35 0,15 5,60 Berbeda bermakna
100 45 18 0,29 0,13 5,05 Berbeda bermakna
KONTROL 75 0
Sedangkan analisis statistika Z-test digunakan untuk menguji apakah ada
perbedaan yang signifikan antara perlakuan dan kontrol. Dari hasil perhitungan
menunjukkan bahwa ada perbedaan yang signifikan antara kontrol dengan
37
perlakuan, sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak daun sirih merah mempunyai
efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.
Pada penelitian sebelumnya, uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih
merah terhadap sel SiHa menghasilkan LC50 sebesar 200,6 µg/ml (Nur’aniyah,
2008), sedangkan LC50 pada penelitian ini lebih kecil yaitu 83,9460 µg/ml.
Semakin kecil LC50 berarti semakin toksik senyawa tersebut terhadap sel SiHa,
karena hanya dengan konsentrasi yang kecil sudah bisa membunuh 50% populasi
sel, sehingga bisa dikatakan bahwa ekstrak heksan daun sirih merah lebih bersifat
sitotoksik dibanding ekstrak etanolik daun sirih merah. Hal ini bisa disebabkan
oleh karena perbedaan pelarut yang digunakan, pada penelitian sebelumnya
digunakan pelarut etanol sedangkan penelitian ini menggunakan pelarut heksan.
Dimana pelarut etanol merupakan pelarut dengan kepolaran tinggi yang bisa
menyari seluruh senyawa dalam daun sirih merah sedangkan pelarut heksan
merupakan pelarut dengan kepolaran rendah yang hanya menyari senyawa dengan
kepolaran rendah seperti minyak atsiri. Dan apabila yang berpotensi sitotoksik
adalah senyawa dengan kepolaran rendah maka penggunaan pelarut heksan akan
memperbesar konsentrasi senyawa sitotoksik sehingga nilai LC50 menjadi lebih
kecil.
Selain pelarut, pemilihan metode penyarian juga mempengaruhi besar
kecilnya LC50. Pada penelitian sebelumnya digunakan metode maserasi,
sedangkan penelitian ini menggunakan metode perkolasi, sehingga bisa diartikan
bahwa metode perkolasi lebih baik dibanding metode maserasi. Hal itu
dikarenakan pada metode perkolasi pelarut dialirkan terus menerus sehingga
38
pelarut selalu berganti baru dan akan meningkatkan perbedaan derajat konsentrasi
yang membuat senyawa dalam daun sirih merah tersebut tersari secara optimal.
Selain berbagai perbandingan hasil dan keunggulan metode penelitian ini
dengan penelitian sebelumnya, ternyata baik penelitian ini maupun penelitian
sebelumnya juga memiliki kelemahan, yaitu tidak menggunakan kelompok
kontrol negatif dari pelarut yang digunakan, yaitu DMSO dan heksan. Telah
diketahui bahwa batas ketoksikan DMSO hanya 10% (Violante, 2002) sehingga
DMSO dikhawatirkan ikut berperan serta dalam kematian sel. Sedangkan penyari
heksan, dalam hal ini ekstrak pekat yang digunakan belum tentu benar-benar
pekat, tidak diketahui berapa banyak penyari heksan yang masih tertinggal di
dalam ekstrak pekat tersebut.
39
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Ekstrak heksan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) memiliki efek
sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.
2. Harga LC50 dengan metode MTT sebesar 102,24 µg/ml.
3. Harga LC50 dengan metode direct counting sebesar 83,95 µg/ml.
B. Saran
1. Perlu digunakan kromatografi gas untuk mendeteksi secara kualitatif dan
kuantitatif senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun sirih merah
terutama untuk senyawa-senyawa yang mudah menguap seperti minyak atsiri.
2. Penelitian lebih lanjut digunakan sel normal dari organ yang sama.
3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan metode yang berbeda,
seperti acid phospate, neutral red. Dan sebaiknya digunakan lebih dari 3
metode untuk memastikan kebenarannya.
4. Perlu digunakan kontrol negatif dari pelarut yang digunakan, seperti DMSO
dan heksan.
5. Perlu dilakukan isolasi senyawa minyak atsiri daun sirih merah dilanjutkan
dengan uji sitotoksik untuk mengetahui senyawa yang spesifik berpotensi
sitotoksik.
40
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-2, 10, Departemen Republik Indonesia,
Jakarta.
Anonim, 2008a, http://www.infopenyakit.com/2008/07/penyakit-kanker-leher-
rahim-serviks.html, diakses 27 Oktober 2008
Anonim, 2008b, http://www.plantamor.com/spcdtail.php?recid=2092, diakses 27
Oktober 2008
Anonim, 2007c, SiHa Cell, http://www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/308.htm, diakses
pada September 2007
Anonim, 2009, Essential Oil Constituent,
http://www.abundanthealth4u.com/Essential_Oils_Constituents_s/41.ht
m, diakses pada 31 Juli 2009
Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi,
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Barille, F.A., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, 2-3, 34-43,
Academic Press, Valencia, Spanyol.
Coll, J. C., Bowdeen, B. F., 1986, The Application of Vacuum Liquid
Chromatography to The Separation of Terpene Mixture, Volume 49,
Nomer 5, 934-936, Journal of Natural Product.
Daris, Azwar, 2009, Fitokimia Mencegah Penyakit Degeneratif,
http://www.isfinational.or.id/pt-isfi-penerbitan/126/476-fitokimia
mencegah-penyakit-degeneratif.html, diakses pada 31 Juli 2009.
Dwikusumaningtyas, E., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih
Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi,
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical
Research, John Willey and Sons Ltd, New York, 12-16, 47-50, 402 –
415.
41
De Muth, James E., 1999, Basic Statistics And Pharmaceutical Statistical
Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York
Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-
73, IRL Press, Washington DC.
Ganiswara, S.G dan Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Immunosupresan dalam
Farmakologi dan Terapi, Edisi 4, editor Sulistia G. Ganiswara dkk, 686-
687, Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia,
Jakarta.
George, H.F., George, J. H., 1999, Biologi, edisi 2, 123, Penerbit Erlangga,
Bandung.
King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd edition, School of Biological Sciences,
University of Surrey, England.
Macdonald F. and Ford C.H.J., 1997, Molecular Biology of Cancer, edisi I, 1-2,
Bios Scientific Publisher Ltd, Oxford OX4 IRE, UK.
Mazzio, E. A., 2009, In Vitro Screening for The Tumoridical Properties of
International Medicinal Herbs, Phytother Res. , NIH Public Access.
Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi dan Biologi, 101-102, 157, Penerbit Ghalia
Indonesia, Jakarta.
Meleka, F.M., 1983, Dimensions of the Cancer Problem, 5-9, Karger, New York.
Meri, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum
Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Neritika, Kartina., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi,
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Nur’aniyah, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
42
Sinardi F., Yuswanto Ag., 2000, Kanker, 1-5, Penerbit Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
Stahl, E., 1969, Thin Layer Chromatography : A Laboratory Handbook, 2 th. Ed.
97 -101, Springer Verlag, Berlin.
Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, cet I, 39-41, P.T.
Agromedia Pustaka, Jakarta.
Suffness, M., dan Pezzuto, J.M., 1991, Assay Related to Cancer Drug Discovery,
Methods in Plant Biochemistry: Assay for Bioactivity, Volume VI, 71-
133, Academic Press, London.
Violante, 2002, Journal Evaluation of The Cytotoxicity Effect of DMSO on CaCo2
Colon Tumor Cell Culture, 1600, Biological and Pharmaceutical
Bulletin Volume 25 No. 12
Wallin, R. F., Arscott, E. F., 1998, A Practical Guide to ISO: Cytotoxicity, an MD
and DI.
Wijesekera, 1991, The Medical Plant Industry, 101, CRC Press, New York.
Foto daun sirih merah (
Lampiran 1
Foto daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
43
Ruiz & Pav)
44
Lampiran 2
Data uji sitotoksisitas fraksi heksan daun sirih merah terhadap sel SiHa
dengan metode MTT
Tabel 11. Data absorbansi fraksi heksan daun sirih merah berbagai
konsentrasi dengan metode MTT
01020304050607080
-2 -1 0 1 2 3 4
% kem
atian
Log konsentrasi
Log konsentrasi vs %kematian (MTT)
Konsentrasi
fraksi heksan
daun sirih
merah (µg/ml)
Absorbansi Rata-rata
absorbans
i
%
kematia
n sel
SiHa
Penetapa
n I
Penetapa
n II
Penetapan
III
2000 0,407 0,395 0,384 0,395 71,15
1000 0,384 0,375 0,380 0,380 72,24
500 0,350 0,344 0,344 0,346 74,73
250 0,423 0,406 0,423 0,417 69,54
125 0,792 0,732 0,724 0,749 45,29
62,5 0,937 0,941 0,974 0,951 30,53
31,25 0,916 0,962 0,974 0,951 30,53
15,625 0,985 0,989 1,001 0,992 27,54
7,813 1,009 1,016 1,033 1,019 25,57
3,906 1,019 0,986 1,008 1,004 26,66
1,953 0,932 0,952 0,983 0,956 30,17
0,977 0,974 0,944 1,004 0,974 28,85
0,488 0,991 1,001 0,986 0,993 27,47
0,244 0,978 0,995 0,987 0,987 27,90
0,122 0,964 0,932 0,981 0,959 29,95
kontrol 1,178 1,474 1,454 1,369
45
Gambar 8. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan sirih merah
terhadap % kematian sel SiHa pada metode MTT
Tabel XII. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah
dengan konsentrasi terpilih dengan metode MTT
Gambar 2. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan sirih merah
terhadap harga probit pada metode MTT
y = 0,623x + 3,748
R² = 0,834
0
1
2
3
4
5
6
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
harga probit
Log konsentrasi
Log konsentrasi vs harga probit
Konsentrasi
ekstrak
heksan daun
sirih merah
(µg/ml)
Rata-rata
absorbansi
%
kematian
sel SiHa
Log
konsentrasi
Harga
probit
1000 0,380 72,24 3 5,58
500 0,346 74,73 2,69 5,67
250 0,417 69,54 2,39 5,52
125 0,749 45,29 2,09 4,87
62,5 0,951 30,53 1,79 4,5
31,25 0,951 30,53 1,49 4,5
15,625 0,992 27,54 1,19 4,42
7,813 1,019 25,57 0,89 4,36
3,906 1,004 26,66 0,59 4,39
46
Lampiran 3
Data uji sitotoksisitas fraksi heksan daun sirih merah dengan metode Direct
Counting
Tabel 13. Data penghitungan hidup dan mati sel SiHa dengan direct counting
Konsentrasi
fraksi heksan
daun sirih
merah
(µg/ml)
Sel SiHa
Penetapan I Penetapan II Penetapan III
Hidup
Mati
Hidup
Mati
Hidup
Mati
300 0 41 0 40 0 41
250 5 37 5 38 5 37
200 14 30 13 31 14 30
150 20 28 20 28 21 28
100 26 26 26 26 26 26
75 31 23 32 23 33 22
50 39 19 38 20 39 19
25 47 17 45 16 46 17
kontrol 76 0 76 0 76 0
� Perhitungan % kematian sel
�������������� � � �� ������� ! ����������� ��� ������� !� ������� ! ���������� �" #$$�
1. Kontrol
Penetapan I = �%&�$���%&
%&�%& �" #$$� = 0
Penetapan II = �%&�$���%&
%&�%& �" #$$� = 0
Penetapan III = �%&�$���%&
%&�%& �" #$$� = 0
2. Konsentrasi 300 µg/ml
Penetapan I = �$�'#���$
$�'# �" #$$� = 100 %
47
Penetapan II = �$�'#���$
$�'# �" #$$� = 100 %
Penetapan III = �$�'#���$
$�'# �" #$$� = 100%
3. Konsentrasi 250 µg/ml
Penetapan I = �(�)%���(
(�)% �" #$$� = 88,0952 %
Penetapan II = �(�)*���(
(�)* �" #$$� = 88,3721 %
Penetapan III = �(�)%���(
(�)% " #$$� = 88,0952 %
4. Konsentrasi 200 µg/ml
Penetapan I = �#'�)$��#'
#'�)$ �" #$$� = 68,1818 %
Penetapan II = �#)�)#��#)
#)�)# �" #$$� = 70,4545 %
Penetapan III = �#'�)$��#'
#'�)$ �" #$$� = 68,1818 %
5. Konsentrasi 150 µg/ml
Penetapan I = �+$�+*��+$
+$�+* �" #$$� = 58,3333 %
Penetapan II = �+$�+*��+$
+$�+* �" #$$� = 58,3333 %
Penetapan III = �+#�+*��+#
+#�+* �" #$$� = 57,1429 %
6. Konsentrasi 100 µg/ml
Penetapan I = �+&�+&���+&
+&�+& �" #$$� = 50 %
Penetapan II = �+&�+&���+&
+&�+& �" #$$� = 50 %
Penetapan III = �+&�+&���+&
+&�+& �" #$$� = 50 %
48
7. Konsentrasi 75 µg/ml
Penetapan I = �)#�+)���)#
)#�+) �" #$$� = 42,5926 %
Penetapan II = �)+�+)��)+
)#�+) �" #$$� = 41,8182 %
Penetapan III = �))�++��))
))�++ �" #$$� = 40 %
8. Konsentrasi 50 µg/ml
Penetapan I = �),�#,��),
),�#, �" #$$� = 32,7586 %
Penetapan II = �)*�+$��)*
)*�+$ �" #$$� = 34,4828 %
Penetapan III = �),�#,��),
),�#, �" #$$� = 32,7586 %
9. Konsentrasi 25 µg/ml
Penetapan I = �'%�#%��'%
'%�#% �" #$$� = 26,5625 %
Penetapan II = �'(�#&��'(
'(�#& �" #$$� = 26,2295 %
Penetapan III = �'&�#%��'&
'&�#% �" #$$� = 26,9841 %
49
konsentrasi
fraksi heksan
(µg/ml)
Persen kematian sel SiHa (%) Probit
Penetapan I Penetapan II Penetapan III Rata-rata
300 100 100 100 100
250 88,0952 88,3721 88,0952 88,1875 6,18
200 68,1818 70,4545 68,1818 68,9394 5,50
150 58,3333 58,3333 57,1429 57,9365 5,20
100 50 50 50 50 5
75 42,5926 41,8182 40 41,4703 4,80
50 32,7586 34,4828 32,7586 33,3333 4,56
25 26,5625 26,2295 26,9841 26,5920 4,39
Konsentrasi Log konsentrasi probit
250 2,4 6,18
200 2,3 5,50
150 2,18 5,20
100 2 5
75 1,88 4,80
50 1,7 4,56
25 1,4 4,39
y = Bx + A
y = 1,603x + 1,916
y = 1,603x + 1,916
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Harga probit
Log konsentrasi
Log konsentrasi vs harga probit (Sel SiHa)
50
y = probit 50 % = 5
5 = 1,603x + 1,916
3,084 = 1,603x
x = 1,924
LC50 = antilog 1,924
= 83,9460 µg/ml
Tabel. Data penghitungan hidup dan mati sel Vero dengan direct counting
Konsentrasi
fraksi heksan
daun sirih
merah
(µg/ml)
Sel Vero
Penetapan I Penetapan II Penetapan III
Hidup
Mati
Hidup
Mati
Hidup
Mati
800 0 42 0 42 0 43
700 5 37 6 37 6 37
600 13 34 13 33 13 33
500 19 30 18 30 18 30
400 26 26 26 26 26 26
300 31 23 32 23 33 23
200 37 20 8 20 38 20
100 44 18 45 18 46 17
kontrol 75 0 75 0 75 0
� Perhitungan % kematian sel
�������������� � � �� ������� ! ����������� ��� ������� !� ������� ! ���������� �" #$$�
1. Kontrol
Penetapan I = �%(�$���%(
%(�%( �" #$$� = 0
Penetapan II = �%(�$���%(
%(�%( �" #$$� = 0
51
Penetapan III = �%(�$���%(
%(�%( �" #$$� = 0
2. Konsentrasi 800 µg/ml
Penetapan I = �$�'+���$
$�'+ �" #$$� = 100 %
Penetapan II = �$�'+���$
$�'+ �" #$$� = 100 %
Penetapan III = �$�'+���$
$�'+ �" #$$� = 100 %
3. Konsentrasi 700 µg/ml
Penetapan I = �(�)%���(
(�)% �" #$$� = 88,0952 %
Penetapan II = �&�)%���&
&�)% �" #$$� = 86,0465 %
Penetapan III = �&�)%���&
&�)% �" #$$� = 86,0465 %
4. Konsentrasi 600 µg/ml
Penetapan I = �#)�)'��#)
#)�)' �" #$$� = 72,3404 %
Penetapan II = �#)�))��#)
#)�)) �" #$$� = 71,7391 %
Penetapan III = �#)�))��#)
#)�)) �" #$$� = 71,7391 %
5. Konsentrasi 500 µg/ml
Penetapan I = �#,�)$��#,
#,�)$ �" #$$� = 61,2245 %
Penetapan II = �#*�)$��#*
#*�)$ �" #$$� = 62,5 %
Penetapan III = �#*�)$��#*
#*�)$ �" #$$� = 62,5 %
6. Konsentrasi 400 µg/ml
52
Penetapan I = �+&�+&���+&
+&�+& �" #$$� = 50 %
Penetapan II = �+&�+&���+&
+&�+& �" #$$� = 50 %
Penetapan III = �+&�+&���+&
+&�+& �" #$$� = 50 %
7. Konsentrasi 300 µg/ml
Penetapan I = �)#�+)���)#
)#�+) �" #$$� = 42,5926 %
Penetapan II = �)+�+)��)+
)#�+) �" #$$� = 41,8182 %
Penetapan III = �))�+)��))
))�+) �" #$$� = 41,0714 %
8. Konsentrasi 200 µg/ml
Penetapan I = �)%�+$��)%
)%�+$ �" #$$� = 35,0877 %
Penetapan II = �)*�+$��)*
)*�+$ �" #$$� = 34,4828 %
Penetapan III = �)*�+$��)*
)*�+$ �" #$$� = 34,4828 %
9. Konsentrasi 100 µg/ml
Penetapan I = �''�#*��''
''�#* �" #$$� = 29,0323 %
Penetapan II = �'(�#*��'(
'(�#* �" #$$� = 28,5714 %
Penetapan III = �'&�#%��'&
'&�#% �" #$$� = 26,9841 %
53
konsentrasi
fraksi heksan
(µg/ml)
Persen kematian sel Vero (%) Probit
Penetapan I Penetapan II Penetapan III Rata-rata
800 100 100 100 100
700 88,0952 86,0465 86,0465 86,7294 6,13
600 72,3404 71,7391 71,7391 71,9395 5,58
500 61,2245 62,5 62,5 62,0748 5,31
400 50 50 50 50 5
300 42,5926 41,8182 41,0714 41,8274 4,80
200 35,0877 34,4828 34,4828 34,6844 4,61
100 29,0323 28,5714 26,9841 28,1959 4,42
Konsentrasi Log konsentrasi probit
700 2,85 6,13
600 2,78 5,58
500 2,7 5,31
400 2,6 5
300 2,48 4,80
200 2,3 4,61
100 2 4,42
y = Bx + A
y = 1,806x + 0,551
y = probit 50 % = 5
5 = 1,806x + 0,551
4,449 = 1,806x
x = 2,463
y = 1,806x + 0,551
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
harga probit
Log konsentrasi
Log konsentrasi vs harga probit(sel Vero)
54
LC50 = antilog 2,463 = 290,4023 µg/ml
Lampiran 4
Analisis Statistik Z-test Fraksi Heksan Daun Sirih Merah
pada Metode Direct Counting
Rumus :
-. � �/-/ � �0-01/�10
2 � 3/�3043.�# � 3.�1/ � 3.�# � 3.�10
Hipotesis :
Hi =proporsi jumlah sel mati pada kontrol dan perlakuan berbeda bermakna
H0=proporsi jumlah sel mati pada kontrol dan perlakuan tidak berbeda bermakna
Keputusan :
Taraf kepercayaan 95% → Z tabel(0,05) = 1.96
H0 ditolak jika Z hitung > 1.96
Tabel 14. Z-test sel SiHa
Konsentrasi
(µg/ml)
Rata-rata sel
SiHa Proporsi
sel mati
perlakuan
(P1)
Propors
i sel
mati
kontrol
(P2)
P0
Z
hitung kesimpulan
hidup mati
300 0 41 1
0
0,35 10,85 Berbeda bermakna
250 5 37 0,88 0,31 14,09 Berbeda bermakna
200 14 30 0,68 0,25 8,25 Berbeda bermakna
150 20 28 0,58 0,23 7,49 Berbeda bermakna
100 26 26 0,50 0,20 6,93 Berbeda bermakna
75 32 23 0,42 0,18 6,13 Berbeda bermakna
50 39 19 0,33 0,14 5,43 Berbeda bermakna
25 46 17 0,27 0,12 4,85 Berbeda bermakna
KONTROL 76 0
55
Tabel 15. Z-test sel Vero
Konsentrasi
(µg/ml)
Rata-rata sel
vero Proporsi
sel mati
perlakuan
(P1)
Propors
i sel
mati
kontrol
(P2)
P0
Z
hitung kesimpulan
hidup mati
800 0 42 1
0
0,36 10,85 Berbeda bermakna
700 6 37 0,86 0,31 9,68 Berbeda bermakna
600 13 33 0,72 0,27 8,67 Berbeda bermakna
500 18 30 0,63 0,24 8,00 Berbeda bermakna
400 26 26 0,5 0,20 6,93 Berbeda bermakna
300 32 23 0,42 0,18 6,13 Berbeda bermakna
200 38 20 0,35 0,15 5,60 Berbeda bermakna
100 45 18 0,29 0,13 5,05 Berbeda bermakna
KONTROL 75 0
56
Lampiran 5. Hasil uji KLT ekstrak heksan daun sirih merah
Keterangan gambar :
Cp = standarcaryophyllen
Ca = standar cavicol
H = ekstrak heksan daun
sirih merah
Fase diam = silika GF 254
Fase gerak = toluen:etil asetat
(93:7)
Deteksi = semprot asam sulfat
dan vanilin
Cp Ca H
57
Keterangan gambar :
Cr = standar carvacrol
H = ekstrak heksan daun
sirih merah
Fase diam = silika GF 254
Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7)
Deteksi = semprot asam sulfat dan
vanilin
Cr H
58
Keterangan gambar :
Ci = standar cineol
H = ekstrak heksan daun
sirih merah
Fase diam = silika GF 254
Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7)
Deteksi = semprot asam sulfat dan
vanilin
Ci H
59
Keterangan gambar :
T = standar tannin
H = ekstrak heksan
daun sirih merah
Fase diam = silika GF 254
Fase gerak = BAW (4:1:5)
Deteksi = reagen FeCl3
T H
60
Keterangan gambar :
K = standar kinin
H = ekstrak heksan
daun sirih merah
Fase diam = silika GF 254
Fase gerak = metanol:amonia
(100:1,5)
Deteksi = semprot
dragendorff
HK
61
Keterangan gambar :
R = standar rutin
H = ekstrak heksan daun
sirih merah
Fase diam = selulosa
Fase gerak = etil asetat:asan asetat:
asam formiat:air
(100:11:11:27)
Deteksi = uap amonia
H R
62
Uji Baku pembanding Hasil
Minyak atsiri Cineol +
Caryophylen -
Carvacrol -
Alkaloid Kinin -
Tanin -
Flavonoid Rutin -
63
Lampiran 6
Foto alat-alat yang digunakan dalam penelitian
perkolator
evaporator
64
mikroskop Cell counter dan haemocytometer
Laminar air flow (LAF)
inkubator
65
Tabung conical, tissue culture flask, 96-well
plate
96-well plate dengan perlakuan
66
Lampiran 7
HARGA PROBIT SESUAI DENGAN PERSENTASENYA
Persentase Probit
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66
10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12
20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45
30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72
40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97
50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23
60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50
70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81
80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23
90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33
99 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 8,88 8,09
(Mursyidi, 1985)
67
68
BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama Presti Arma Edytianingsih yang lahir pada
tanggal 19 Mei 1987 di Magelang, Jawa Tengah. Penulis
merupakan putri pertama dari pasangan Eddy Saptono dan Esti
Hari Isniyati. Penulis memulai pendidikan formalnya di TK
Masyitoh 6 Magelang pada tahun 1991. Penulis melanjutkan
pendidikan dasar di SD Negeri Cacaban 4 Magelang pada tahun 1993-1999.
Kemudian dilanjutkan di SLTP Negeri 6 Magelang pada tahun 1999-2002.
Penulis melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 2 Magelang pada tahun 2002-
2005, lalu melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta pada tahun 2005.